枯草芽孢杆菌G8发酵条件的优化、抗菌物质的部分特性分析及分离纯化

摘要

枯草芽孢杆菌G8对多种植物病原真菌具有拮抗作用，其抑菌机制是产生抗菌蛋白。本论文对G8的发酵培养基组分和发酵条件进行了优化，测定了抗菌蛋白的部分理化性质并对其进行了分离纯化，为研究抗菌蛋白的性质和结构、防病机理及菌株的遗传改良奠定基础。 1、为提高枯草芽孢杆菌G8抗菌蛋白的产量，采用单因素和正交试验设计，通过摇瓶培养对枯草芽孢杆菌G8产生抑菌活性物质的发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明，优化培养基配方(g/L)为：玉米淀粉5g、大豆蛋白胨5g、NH4Ac20g、CaCO30.5g；最适接种体培养时间12h；适宜发酵条件为：初始pH7、温度35℃、接种量3％、装液量70～100mL/250mL、转速180r/min、最佳培养时间48h。在上述优化条件下获得发酵液活性是LB培养基的2.1倍，硫酸铵沉淀后蛋白质浓度达103.9mg/L，为LB培养基的2.3倍。 2、为明确枯草芽孢杆菌G8抗菌蛋白的理化性质，研究了温度、pH、金属离子、表面活性剂和蛋白酶对其稳定性的影响，并使用特殊培养基测定了其分解特定底物的能力。结果表明，该抗菌蛋白具有较强的热稳定性，100℃处理1h后基本保持完全的活性，121℃高压处理30min后，仍能保持90％以上的活性；对酸较稳定，可忍受pH为2的酸度：对金属离子不敏感；和表面活性剂可发生相互作用；对胰蛋白酶和胃蛋白酶有一定耐受力，对蛋白酶K较敏感。底物特异性试验表明活性蛋白不是几丁质酶、羧甲基纤维素酶和β-1，3-葡聚糖酶。 3、硫酸铵沉淀的样品经SephadexG-100凝胶层析、CelluloseDE-52阴离子交换层析、CMSepharoseCL-6B阳离子交换层析、Pheny-Sepharose6FF疏水层析，结合SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE和活性测定，推测该活性物质为分子量约4000Da的肽类。盐酸沉淀、甲醇抽提后的样品经TLC、IR分析表明可能是一线形脂肽类物质。 4、评价了枯草芽孢杆菌G8抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌的抑制效果。采用菌丝生长速率法测定了其对黄瓜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum菌丝生长的毒力，结果表明，此抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌菌丝生长的EC50值为12.4μg/mL，明显低于对照药剂乙霉威及嘧霉胺。此外，渗透势试验发现该抗菌蛋白可使黄瓜菌核病菌菌丝细胞膜透性发生变化，致使胞内物质外渗，病菌菌丝明显变细。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

1引言

1.1枯草芽孢杆菌在病害生物防治中的应用现状

1.1.1国外应用现状

1.1.2国内应用现状

1.2枯草芽孢杆菌在植物病害防治中的作用机制

1.2.1竞争作用

1.2.2拮抗作用

1.2.3诱导抗性

1.2.4促生作用

1.3生防枯草芽孢杆菌研发与应用途径

1.3.1生防枯草芽孢杆菌的育种研究

1.3.2发酵培养研究

1.3.3剂型和配方研究

1.4枯草芽孢杆菌在病害防治应用中存在的问题及措施

1.4.1与化学农药或抗生素复配防病

1.4.2与其它拮抗微生物协同防病

1.5本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1供试菌株

2.1.2供试培养基

2.1.3主要仪器与试剂

2.2抑菌活性测定方法

2.2.1平板对峙法(方中达，2008)

2.2.2生长速率法(方中达，2008)

2.2.3琼脂孔扩散对峙法（Hultmark D,1980）

2.3拮抗菌株的活化与保藏

2.4无菌发酵液的制备方法

2.5菌株诱变试验

2.5.1 G8菌株对数生长期的测定

2.5.2 G8菌悬液的制备

2.5.3诱变处理

2.5.4拮抗活性的检测

2.6 G8发酵条件优化

2.6.1液体种子的制备

2.6.2发酵培养

2.6.3培养基组分筛选单因素试验

2.6.4培养基组分的正交试验

2.6.5培养条件的优化

2.6.6活性测定

2.7抗菌蛋白的提取及含量测定

2.7.1抗菌蛋白的提取及最佳硫酸铵饱和度的确定

2.7.2蛋白含量测定方法

2.8抗菌蛋白部分特性分析

2.8.1蛋白的热稳定性

2.8.2金属离子和表面活性剂对蛋白活性的影响

2.8.3蛋白酶对活性的影响

2.8.4 pH值对活性的影响

2.8.5细胞壁降解酶活性检测

2.9抗菌蛋白的柱层析纯化

2.9.1 Sephadex G-100凝胶层析

2.9.2 DE-52阴离子交换层析

2.9.3 CM Sepharose CL-6B阳离子交换层析

2.9.4 Pheny-Sepharose 6 FF疏水层析

2.9.5纯度检测及分子量的测定

2.10抗菌蛋白的薄层层析纯化

2.10.1蛋白的提取

2.10.2薄层层析(TLC)

2.10.3 RP-HPLC

2.11红外光谱(IR)分析

2.12抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌菌丝的毒力测定

2.13抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌菌丝体细胞膜透性的影响

3结果与分析

3.1菌株诱变试验

3.1.1 G8菌株对数生长期的测定

3.1.2 G8菌株紫外复合LiC1诱变结果

3.2 G8发酵条件的优化

3.2.1培养基的优化

3.2.2发酵条件的优化

3.3蛋白提取和含量测定

3.3.1最佳硫酸铵饱和度的确定

3.3.2蛋白质含量标准曲线绘制

3.4抗菌蛋白部分特性分析

3.4.1蛋白的热稳定性

3.4.2金属离子和表面活性剂对蛋白活性的影响

3.4.3蛋白酶对活性的影响

3.4.4 pH值对活性的影响

3.4.5细胞壁降角犁酶活性检测

3.5抗菌蛋白的柱层析纯化

3.5.1 Sephadex G-100凝胶层析

3.5.2 DE-52阴离子交换层析

3.5.3 CM Sepharose CL-6B阳离子交换层析

3.5.4.Pheny-Sepharose 6 FF疏水层析

3.5.6纯度检测及分子量的测定

3.6抗菌蛋白的薄层层析纯化

3.6.1甲醇抽提沉淀样品的TLC

3.6.2两种蛋白沉淀方法的比较

3.6.3条带活性的测定

3.6.4表面张力的测定

3.6.5排油活性试验

3.6.6 RP-HPLC法鉴定纯度

3.7红外光谱(IR)分析

3.8抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌菌丝的毒力

3.9抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌菌丝体细胞膜透性的影响

4讨论

4.1 G8发酵条件优化的目的意义

4.2抗菌蛋白的理化性质

4.3 G8抗菌蛋白的纯化

4.4抗菌蛋白对黄瓜菌核病菌细胞膜透性的影响

5结论

5.1枯草芽孢杆菌G8的发酵条件优化

5.2抗菌蛋白的理化特性

5.3抗菌蛋白的分离纯化

5.4抗菌蛋白的毒力和其对病菌细胞膜透性的影响

6参考文献

7致谢

8攻读硕士学位期间发表论文情况