苦荞蛋白的制备、生物活性鉴定及其在猪群中的应用

摘要

荞麦是一种粮药兼用的农作物，富含多种营养成分，包括蛋白质、膳食纤维、黄酮类物质以及矿物元素等。苦荞蛋白的氨基酸组成比较特别，其营养价值高于大豆、小麦、玉米等作物。已有研究发现荞麦蛋白或多肽具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、降胆固醇等多种生理活性，因此在饲料添加剂方面有广阔的应用前景。本研究成功提取了苦荞蛋白，并对其体内、外生物活性和功能进行了探讨，研究包括以下4个方面:
　　1.苦荞蛋白的提取与分离纯化
　　采用硫酸铵盐析法提取得到苦荞蛋白粗提物，然后分别采用DEAE-Sepharose离子交换和Sephadex G-75凝胶过滤层析对苦荞蛋白粗提物进行分离纯化，SDS-PAGE法分别测定了苦荞蛋白粗提物和分离峰的分子量。结果发现苦荞蛋白粗提物中的蛋白分子量大小主要介于11KDa-60KDa之间，而活性峰的分子量为38KDa，将其命名为苦荞盐溶性球蛋白(WSBWP)。
　　2.苦荞盐溶性球蛋白(WSBWP)的结构特征研究分别采用Edman测序法和MALDI-TOF质谱法分析了苦荞盐溶性球蛋白(WSBWP)的一级结构，根据测序结果和Mascot蛋白质数据库搜索结果发现其蛋白质前体共由393个氨基酸残基组成，其中信号肽由22个氨基酸残基组成，成熟肽由371个氨基酸残基组成。该序列与苦荞种子贮存蛋白13S球蛋白的α亚基的N末端氨基酸序列完全一致，说明WSBWP很可能就是苦荞种子贮存蛋白13S球蛋白的酸性亚基。以籽粒苋种子贮存蛋白中的11S球蛋白为模板（同源性为43.65％）,在SWISS-MODEL工作平台上进行同源建模，构建了WSBWP的三维模型，与大豆11S球蛋白结构相似，因此WSBWP属于大豆11S球蛋白超家族的一员。
　　3.苦荞盐溶性球蛋白(WSBWP)及其活性肽的体外活性研究
　　采用体外研究方法分别检测了苦荞盐溶性球蛋白和其酶解活性肽(Pep-1-4)的抗菌活性、胆酸盐吸附活性、自由基清除能力和抑制肿瘤细胞增殖的活性。抗菌活性检测发现样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用;体外胆酸盐吸附活性研究表明WSBWP、多肽Pep-1和Pep-3对胆酸钠、牛磺胆酸钠和脱氧胆酸钠三种胆酸盐都有一定的吸附能力，而WSBWP的胆酸盐吸附能力不如多肽强;抗氧化活性研究检测了样品自由基(OH·)的清除能力，发现WSBWP、多肽Pep-1和Pep-3对OH·都有一定的清除能力;MTT法分别检测了苦养活性肽对人乳腺癌MCF-7细胞、人胃癌MGC80-3细胞和人结肠癌Caco-2细胞的增殖抑制活性，结果该活性肽对MCF-7细胞的增殖抑制作用比较明显，其抑制效果强于对MGC80-3细胞和Caco-2细胞的抑制作用。
　　4.苦荞蛋白在猪群中的应用研究初探
　　1)苦荞蛋白在断奶仔猪生产中的应用研究初探
　　在断奶仔猪基础日粮中添加苦荞蛋白后，发现断奶仔猪平均日增重比对照组增加了36.84％，料重比下降了33.33％，腹泻率下降了41.6％，说明食用苦荞蛋白提高了断奶仔猪的生长性能和抗病力。血液生化分析发现实验组仔猪血液中的总胆固醇(TC)水平降低了16.75％，而甘油三酯(TG)水平降低了39.73％，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平明显增加，而且HDL-C与LDL-C的比率增加了32.94％;仔猪血清中的谷丙转氨酶(GPT)水平比对照组高出32.64％，而谷草转氨酶(GOT)水平比对照组高出28.07％，碱性磷酸酶(AKP)水平比对照组略有升高。通过测胃液pH发现苦荞蛋白组的仔猪胃液pH由4.28降至3.69。同时，苦荞蛋白组的仔猪胃的相对重量比对照组增加了20.44％，肝脏相对重量比对照组减少了19.31％。通过Miseq高通量测序得到了断奶仔猪粪便样品的微生物组成多样性，在门水平分析发现样品中的优势菌主要是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。在属水平分析发现，仔猪食用苦荞蛋白后，肠道中的乳酸菌(Lactobacillus)、瘤胃菌(Ruminococcus)和经粘液真杆菌(Blautia)的含量明显增加;但一些致病菌如普雷沃菌(Prevotella)、链球菌(Streptococcus)的含量明显下降。结果认为，饲料中给仔猪添加苦荞蛋白后可提高断奶仔猪平均日增重、降低料重比，且可改善胃酸分泌，明显降低腹泻率。此外，实验组仔猪的胆固醇、甘油三酯等血液生化指标优于对照组，肠道菌群组成也发生了明显的改善。
　　2)苦荞蛋白在育肥猪生产中的推广应用
　　苦荞蛋白在断奶仔猪取得较好的试验效果后，采用80头体重在80-90 kg的长白猪、大白猪和太湖黑猪（长×大×太）三元杂交的育肥猪为研究对象进行了推广试验。试验过程将育肥猪随机分两组，对照组和实验组各40头猪，试验组日粮中添加5％荞麦蛋白，对照组添加等量的大豆蛋白，饲喂时间持续一个月，每天观察猪只生长状态并记录。试验开始和试验结束前分别将育肥猪空腹12小时，逐头称体重。平时记录采食量并结算饲料消耗情况，计算平均日增重(ADG)、料重比(F/G)以及出栏率。在育肥猪的推广实验表明，实验组育肥猪的平均日增重比对照组增加了22.22％，与对照组相比料重比下降了14.29％(p＜0.05)，提示育肥猪基础日粮添加苦荞蛋白后能够促进育肥猪生长，提高饲料转化率。

目录

声明

摘要

本文主要缩略符号

引言

第一篇 文献综述

1 苦荞蛋白及多肽的来源与分类

1．1 苦荞蛋白的来源与分类

1．2 苦荞活性肽的种类

2 苦荞蛋白及多肽的生理功能

2．1 荞麦抗菌肽的结构及功能

2．2 荞麦胰蛋白酶抑制剂的结构与功能

2．3 荞麦蛋白的抗肿瘤功能

2．4 荞麦蛋白的降胆固醇功畿

2．5 荞麦多肽的降血压功能

2．6 荞麦蛋白的降血糖功能

3 饲用抗生素作为动物促生长剂使用的局限性及导致问题

3．1 畜禽产品中的抗生素残留超标影响食品安全

3．2 滥用抗生素引起的细菌耐药性危害人畜安全

4 新型抗生素替代物的种类及其应用前景

4．1 植物提取物

4．2 低聚糖

4．3 酸化剂

4．4 抗菌肽

5 肠道菌群平衡对猪生产性能的影响和作用

5．1 肠道菌群的作用与功能

5．2 微生态制剂有利于提高猪的生产性能

参考文献

第二篇 实验研究

第一章 苦荞蛋白的提取与分离纯化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 本章小结

参考文献

第二章 苦荞盐溶性球蛋白的结构特征研究

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 本章小结

参考文献

第三章 苦荞球蛋白及活性肽的体外活性研究

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 本章小结

参考文献

第四章 荞麦蛋白对断奶仔猪生产中的应用研究初探

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 本章小结

参考文献

第五章 推广应用-苦荞蛋白对育肥猪生产性能的影响

1．1 实验动物

1．2 饲养管理

1．3 测定指标

1．4 统计学分析

2 实验结果

3 案例推广结论

全文结论

本文创新点

致谢