苦荞过敏蛋白C端结构域的原核表达及其免疫学活性的鉴定

摘要

荞麦(Fagopyrumesculentum)作为一种功能性食物，越来越受到人们的广泛关注。它不仅具有丰富的营养价值，而且还有很高的药用价值。荞麦蛋白由较为独特的氨基酸组成。许多实验表明荞麦中的黄酮类物质含量较高，其产品具有明显的降低胆固醇和降血压等生物学作用，而且对糖尿病也有一定的疗效。然而，近年来的研究发现，荞麦中含有的过敏性成分通常可使接触或食用它的人产生过敏症状。日本和韩国学者先后从甜荞麦中分离获得16kDa、22-24kDa、34-38kDa及69kDa等分子量不等的过敏蛋白。虽然对荞麦主要过敏原的确定还没有得到统一，各个研究小组的报道也存在一些差异，但一般认为22-24kDa蛋白是荞麦中的主要过敏原。目前，国内外关于苦荞麦过敏的研究较少。本实验室曾以我国云南苦荞种子为原料，经分离纯化获得纯度均一的24kDa天然蛋白，命名为TBa(tartarybuckwheatallergen)，通过免疫学检测发现其为苦荞中的主要过敏原。之后采用基因克隆法首次获得该苦荞过敏原的结构基因序列，并于2002年在GenBank登录(登录号为AY044918)。 本实验是在已获得TBa结构基因的基础上，进行TBa的原核表达。首先将该基因克隆到原核表达载体pET-28a上，后将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。结果表达产物大部分以包涵体的形式存在，进一步经Ni2+-NTA琼脂糖柱亲和纯化，得到纯度达95％以上的目的蛋白。用透析复性的方法将目的蛋白复性，复性产率达到约68％。Westernblot证实目的蛋白N端带有6个组氨酸标签。ELISA检测表明目的蛋白与IgE有特异性的结合，具有较高的免疫学活性。 根据TBa的结构基因序列推导出该蛋白的氨基酸编码序列，应用Antigenic程序对推导出来的氨基酸序列进行抗原表位预测。初步的预测结果表明在成熟的TBa分子中包含八个抗原表位区段。选择含有抗原决定簇可能性最大的两个区段，根据其碱基序列，设计引物，克隆获得两个表位的基因片段。分别将两个基因片段连接到原核表达载体pET-32a上，并将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。对分离纯化后的表达产物进行免疫活性鉴定，初步表明两个推测的抗原表位区段均具有一定的抗体结合活性。 本实验通过构建原核表达载体，优化表达条件，实现了苦荞过敏蛋白TBa在原核细胞中的高效表达。免疫活性鉴定结果表明：重组苦荞麦过敏蛋白与来自天然苦荞种子中的该过敏蛋白具有相似的免疫学活性，与荞麦过敏病人血清中的IgE有特异性的结合。这为荞麦食品、产品过敏研究提供了理论依据。同时对含有抗原决定簇可能性最大的两个区段进行克隆、表达及初步活性分析，为进一步研究该过敏蛋白的致敏机理，揭示其结构与功能的关系及其抗原表位的分析奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

第一章文献综述

第二章苦荞过敏蛋白C端结构域TBa原核表达载体的构建

第三章苦荞过敏蛋白C端结构域TBa的原核表达及免疫学活性的初步鉴定

第四章苦荞过敏蛋白C端结构域抗原表位的初步研究

第五章小结及展望

参考文献

致谢

附录

承诺书