一种高活性苦荞13S球蛋白的超高压制备方法

摘要

本发明公开了一种高活性苦荞13S球蛋白的超高压制备方法，其特征在于，将苦荞粉溶于蒸馏水中，搅拌后离心，取上清液，所得沉淀冷冻干燥，即得苦荞粗蛋白粉；将苦荞粗蛋白粉与Tris‑HCL缓冲液混合，搅拌后离心，即得苦荞13S球蛋白，纯化后冷冻干燥，得到的苦荞13S球蛋白冻干粉与Gly‑HCL缓冲液进行配制成溶液，放入真空包装袋中，随后放入超高压设备的处理腔中进行处理，取出后冷冻干燥，即得到高活性苦荞13S球蛋白粉。本发明以苦荞粉为原料结合超高压技术制备得到苦荞13S球蛋白，有效改善了苦荞13S球蛋白的溶解性、乳化性以及起泡性，对于开展荞麦食品的深加工以及工业化发展具有指导意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高活性苦荞13S球蛋白的制备方法，属于蛋白质加工技术领域。

背景技术

苦荞(Fagopyrum tartaricum Gaertn)是亚洲和中东欧的传统作物，中国是世界苦荞的最大生产国，其次是俄罗斯和朝鲜。近年来，苦荞作为一种功能营养食品的极好资源越来越受到食品与营养界的极大关注。苦荞蛋白是苦荞中最主要的生物活性物质，其氨基酸组成均衡，且富含人体限制性氨基酸—赖氨酸，其生物价相当于脱脂奶粉生物价的92.3％、鸡蛋生物价的81.5％，但由于苦荞中含有单宁、植酸和蛋白酶抑制剂，使得苦荞蛋白具有较低的消化率，其中蛋白酶抑制剂还可能导致人的过敏反应。

目前，超高压处理技术(Ultra-High Pressure，简称UHP)在国外食品中的应用越来越广泛，其作为一种冷杀菌技术比热加工(Hot Working Technology，简称HWT)对食物的营养和感官品质破坏较小。超高压处理技术(Ultra-High Pressure,简称UHP)作为一种非热加工技术的代表，能修饰蛋白质中的二、三、四级结构，即会通过影响蛋白质的氢键、离子键、疏水键等非共价键，从而改变蛋白结构，提高蛋白质活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种苦荞13S球蛋白的超高压制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高活性苦荞13S球蛋白的超高压制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)：将苦荞粉溶于蒸馏水中，调整pH至碱性，搅拌后离心，取上清液，调整pH至酸性，待沉淀后，洗涤沉淀物，再次调整沉淀物pH至碱性，冷冻干燥，即得苦荞粗蛋白粉；

步骤2)：将苦荞粗蛋白粉与Tris-HCL缓冲液混合，搅拌后离心，即得苦荞13S球蛋白；

步骤3)：选择葡聚糖凝胶Sephadex G-75为色谱柱填料，利用GE-AKTAPURIFIER 10蛋白纯化仪对苦荞13S球蛋白进行纯化后，将获得的样品溶液进行冷冻干燥，得到苦荞13S球蛋白冻干粉；

步骤4)：将超高压设备的水浴循环装置预热；将苦荞13S球蛋白冻干粉，与Gly-HCL缓冲液进行配制成溶液，放入真空包装袋中，随后放入超高压设备的处理腔中进行处理，取出后，将获得的样品溶液进行冷冻干燥，即得到高活性苦荞13S球蛋白粉。

优选地，所述步骤1)中苦荞粉与蒸馏水的质量比为1:10；所述调整pH的试剂依次为用1mol/L NaOH溶液调整pH至8.0，用1mol/L HCL溶液调整pH至4.5，用0.1mol/L NaOH调整pH至8.0；所述搅拌的温度4℃，转速为50r/min，时间为2h；所述离心的转速为5000r/min，时间为20min；所述冷冻干燥的时间为24h。

优选地，所述步骤1)所得苦荞粗蛋白粉中蛋白质的质量含量为85.3％，黄酮的质量含量为0.012％。

优选地，所述步骤2)中Tris-HCL缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH值为8.0；所述苦荞粗蛋白粉与Tris-HCL缓冲液的质量比为1：10；所述搅拌的温度为20℃，时间为1.5h；所述离心的转速为4000rpm，时间为15min。

优选地，所述步骤3)中冷冻干燥的温度为-80℃，时间为24h。

优选地，所述步骤4)中Gly-HCL缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为3.0；所述苦荞13S球蛋白冻干粉与Gly-HCL缓冲液进行配制成溶液的浓度为10～15mg/mL；所述冷冻干燥的温度为-80℃，时间为18～24h。

优选地，所述步骤4)中超高压设备的水浴循环装置预热至20℃；所述超高压设备的处理具体为：先设置压力为100～500MPa，保压时间为10～30min，泄压过程在3s内完成。

本发明以苦荞粉为原料结合超高压技术制备得到苦荞13S球蛋白，有效改善了苦荞13S球蛋白的溶解性、乳化性以及起泡性，对于开展荞麦食品的深加工以及工业化发展具有指导意义。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。

实施例1-3中参考Xue S和Cuiping Yu等人的方法测定苦荞13S球蛋白溶解性、乳化与乳化稳定性，及起泡性与泡沫稳定性。(Xue S,Xu X,Shan H,et al.Effects of high-intensity ultrasound,high-pressure processing,and high-pressurehomogenization on the physicochemical and functional properties ofmyofibrillar proteins[J].Innovative Food Science&Emerging Technologies,2018,45:354-360.Cuiping Yu,Fan Wu,Yue Cha,et al.Effects of high-pressurehomogenization on functional properties and structure of mussel(Mytilusedulis)myofibrillar proteins[J].International Journal of BiologicalMacromolecules,2018,134(118):741-746.)

实施例1

一种高活性苦荞13S球蛋白的超高压制备方法，包括以下步骤：

1、苦荞粗蛋白粉的制备

称取适量的苦荞粉，按料液比1:10溶于蒸馏水中，用1mol/L NaOH溶液调整pH＝8.0，并在温度4℃，转速50r/min的条件下搅拌2h后，5000r/min离心20min，并取上清液，最后用1mol/L HCL溶液调整pH＝4.5，待沉淀后，用蒸馏水洗涤沉淀2-3次，再使用用0.1mol/LNaOH中和调整pH＝8.0，最后冷冻干燥24h，即得苦荞粗蛋白粉(其中蛋白质含量为85.3％，黄酮含量为0.012％)。

2、苦荞13S球蛋白的制备

将步骤a所得苦荞粗蛋白粉与0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH 8.0)，按照1：10的料液比(W/W)混合，在温度20℃下搅拌1.5h后4000rpm离心15min，即得苦荞13S球蛋白。

3、苦荞13S球蛋白的纯化

选择葡聚糖凝胶Sephadex G-75为色谱柱填料，利用GE-AKTAPURIFIER 10蛋白纯化仪对步骤b所得苦荞13S球蛋白进行纯化后，将获得的样品溶液进行冷冻干燥，冻干时间为24h，得到苦荞13S球蛋白的冻干粉。

4、超高压处理

将超高压设备的水浴循环装置预热至20℃，并将步骤c所得苦荞13S球蛋白冻干粉，与0.05mol/L Gly-HCL缓冲液(pH 3.0)进行配制，配制浓度为：10mg/mL，放入真空包装袋中，随后将样品放入超高压处理腔中，压力分别设置为100MPa，保压时间分别设置为10min，泄压过程在3s内完成，取出后，将获得的样品溶液进行冷冻干燥，冻干时间为24h，即得到高活性苦荞13S球蛋白粉。

参考Xue S和Cuiping Yu等人的方法测定苦荞13S球蛋白溶解度为78.3％、乳化性为67.5m2/g、乳化稳定性为45.1％、起泡性为82.3％、泡沫稳定性为43.8％。

实施例2

一种高活性苦荞13S球蛋白的超高压制备方法，包括以下步骤：

1、苦荞粗蛋白粉的制备

称取适量的苦荞粉，按料液比1:10溶于蒸馏水中，用1mol/L NaOH溶液调整pH＝8.0，并在温度4℃，转速50r/min的条件下搅拌2h后，5000r/min离心20min，并取上清液，最后用1mol/L HCL溶液调整pH＝4.5，待沉淀后，用蒸馏水洗涤沉淀2-3次，再使用用0.1mol/LNaOH中和调整pH＝8.0，最后冷冻干燥24h，即得苦荞粗蛋白粉(其中蛋白质含量为85.3％，黄酮含量为0.012％)。

2、苦荞13S球蛋白的制备

将步骤a所得苦荞粗蛋白粉与0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH 8.0)，按照1：10的料液比(W/W)混合，在温度20℃下搅拌1.5h后4000rpm离心15min，即得苦荞13S球蛋白。

3、苦荞13S球蛋白的纯化

选择葡聚糖凝胶Sephadex G-75为色谱柱填料，利用GE-AKTAPURIFIER 10蛋白纯化仪对步骤b所得苦荞13S球蛋白进行纯化后，将获得的样品溶液进行冷冻干燥，冻干时间为24h，得到苦荞13S球蛋白的冻干粉。

4、超高压处理

将超高压设备的水浴循环装置预热至20℃，并将步骤c所得苦荞13S球蛋白冻干粉，与0.05mol/L Gly-HCL缓冲液(pH 3.0)进行配制，配制浓度为：13mg/mL，放入真空包装袋中，随后将样品放入超高压处理腔中，压力分别设置为300MPa，保压时间分别设置为20min，泄压过程在3s内完成，取出后，将获得的样品溶液进行冷冻干燥，冻干时间为24h，即得到高活性苦荞13S球蛋白粉。

参考Xue S和Cuiping Yu等人的方法测定苦荞13S球蛋白溶解度为87.5％、乳化性为72.1m2/g、乳化稳定性为50.1％、起泡性为76.2％、泡沫稳定性为40.8％。

实施例3

一种高活性苦荞13S球蛋白的超高压制备方法，包括以下步骤：

1、苦荞粗蛋白粉的制备

称取适量的苦荞粉，按料液比1:10溶于蒸馏水中，用1mol/L NaOH溶液调整pH＝8.0，并在温度4℃，转速50r/min的条件下搅拌2h后，5000r/min离心20min，并取上清液，最后用1mol/L HCL溶液调整pH＝4.5，待沉淀后，用蒸馏水洗涤沉淀2-3次，再使用用0.1mol/LNaOH中和调整pH＝8.0，最后冷冻干燥24h，即得苦荞粗蛋白粉(其中蛋白质含量为85.3％，黄酮含量为0.012％)。

2、苦荞13S球蛋白的制备

将步骤a所得苦荞粗蛋白粉与0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH 8.0)，按照1：10的料液比(W/W)混合，在温度20℃下搅拌1.5h后4000rpm离心15min，即得苦荞13S球蛋白。

3、苦荞13S球蛋白的纯化

选择葡聚糖凝胶Sephadex G-75为色谱柱填料，利用GE-AKTAPURIFIER 10蛋白纯化仪对步骤b所得苦荞13S球蛋白进行纯化后，将获得的样品溶液进行冷冻干燥，冻干时间为24h，得到苦荞13S球蛋白的冻干粉。

4、超高压处理

将超高压设备的水浴循环装置预热至20℃，并将步骤c所得苦荞13S球蛋白冻干粉，与0.05mol/L Gly-HCL缓冲液(pH 3.0)进行配制，配制浓度为：15mg/mL，放入真空包装袋中，随后将样品放入超高压处理腔中，压力分别设置为500MPa，保压时间分别设置为30min，泄压过程在3s内完成，取出后，将获得的样品溶液进行冷冻干燥，冻干时间为24h，即得到高活性苦荞13S球蛋白粉。

参考Xue S和Cuiping Yu等人的方法测定苦荞13S球蛋白溶解度为92.1％、乳化性为75.5m2/g、乳化稳定性为60.1％、起泡性为78.8％、泡沫稳定性为38.3％。