苦荞过敏蛋白TB24kDa的原核表达纯化及免疫活性的鉴定

摘要

荞麦具有较高营养品质和药用价值,并富含多种生物活性物质,在防治现代文明病诸如糖尿病、高血压等心脑血管疾病和风湿性关节炎等方面有一定的功效.然而荞麦中含有的过敏性成份又使许多接触或食用它的人产生过敏症状.近些年来,一些国外的科学家对甜荞(common buckwheat CB)中的过敏成分进行了研究.但在苦荞(tartary buckwheat TB)过敏成分研究方面的报道却不多,有关苦荞过敏蛋白基因的重组表达和抗原决定簇的研究尚属空白.TB24kDa蛋白是苦荞中的主要过敏蛋白,确定此蛋白中的抗原决定簇并对其进行免疫学和分子遗传学上的研究,将有助于了解过敏反应机制并为荞麦过敏症的免疫治疗和低敏品种的培育提供科学依据.该研究的目的在于表达重组的苦荞主要过敏蛋白(TB24kDa),并对其进行纯化和免疫活性的测定,从而为进一步寻找其抗原决定簇奠定坚实的基础.该实验以pQE-31为表达载体,M15为表达菌株,使用IPTG诱导,在37°C获得了以包涵体形式存在的表达产物.经Western Blotting检测,证明表达条带N端带有Histidine tag.使用8mol/L尿素初步纯化和进一步的Hitrap Chelating HP亲和纯化后,得到了纯度在90％以上的目的蛋白.对包涵体蛋白进行了透析复性和Ni<'2+>柱亲和固定复性,得到了可溶性的蛋白.为了制备抗血清,用于检测重组蛋白的免疫活性,从苦荞种子中提取并纯化了天然的TB24kDa,并对小鼠进行了免疫.通过对小鼠血清IgE的检测,得到了可用于下一步重组蛋白免疫活性鉴定的小鼠抗血清.利用此抗血清,通过竞争ELISA检测重组蛋白的免疫活性,发现重组蛋白与IgE抗体有结合活性.

目录

Astract

第一章文献综述

1、过敏反应及其病理机制的研究

2、食物过敏及其诊断、治疗手段的研究进展

3、植物过敏蛋白分类、特性及研究现状

4、荞麦过敏的研究现状

5、展望

第二章苦荞过敏蛋白TB22kDa的原核表达

1、材料

2、方法

3、结果

4、分析与讨论

第三章重组蛋白TB22kDa的纯化及变复性研究

1、原理

2、材料与设备

3、方法

4、结果

5、分析和讨论

第四章重组蛋白TB22kDa的免疫活性的鉴定

1材料

2、方法

3、结果

4、分析与讨论

第五章小结

参考文献

致谢