绿脓菌素对食源细菌生长和成膜影响的初步研究

摘要

食源性病原菌污染是导致食源性疾病的主要原因。在食品生产加工环境中，食源性病原菌能在工厂的天花板、地板、产品输送管道、生产容器、尤其易在某些潮湿且不易清洗的材料表面形成菌膜，细菌形成菌膜之后抗逆性、耐药性显著增强，为食品安全埋下隐患。因此需要寻找新途径和新靶点有效阻断菌膜的形成，消除交叉感染/污染源。绿脓菌素(PYO)是铜绿假单胞菌分泌的一种具有氧化还原活性的次级代谢物。研究表明，绿脓菌素可干扰宿主细胞中的多种细胞功能包括电子传递、细胞呼吸、能量传递、基因表达和先天免疫机制等。但目前国内外对食源铜绿假单胞菌绿脓菌素的产生及其对食品加工环境中常见食源细菌生长和成膜影响尚未报道。本文基于绿脓菌素的氧化还原特性，采用电化学扫描显微分析(SECM)中方波伏安法(SWV)和分光光度法研究了铜绿假单胞菌生长过程中绿脓菌素的产生及其在不同体系中对食源细菌生长和成膜的影响，主要结果如下:
　　1.建立了电化学方波伏安法(SWV)和分光光度法相结合测定铜绿假单胞菌生长及其生长过程中所产生PYO的方法。对于电化学SWV法，PYO在-0.33 V有最大电流峰，该峰可作为定性和定量测定铜绿假单胞菌生长过程中PYO的特征峰;对于分光光度法，PYO在685 nm有最大吸收波长，该波长也可以用来定性和定量测定铜绿假单胞菌生长过程中PYO的变化，通过分光光度法研究了摇床培养（氧气充足）和静置培养（氧气缺乏）的条件下，细菌的生长状况以及相应PYO含量的变化。结果表明，PYO在介导菌膜形成方面具有促进作用。
　　2.采用分光光度法研究了不同浓度（0μmol/L、30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L）PYO对3种食品加工环境中常见食源细菌（铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌）的生长影响，结果表明，不同浓度PYO对铜绿假单胞菌生长具有一定的促进作用，对荧光假单胞菌以及大肠杆菌的生长均有不同程度的抑制作用，浓度越高抑制作用越强，其中70μmol/L PYO对大肠杆菌生长抑制作用最强。同时研究了不同抗氧化试剂(NAC、SOD、AA)对PYO介导下大肠杆菌生长的影响，不同抗氧化剂均在不同程度对菌体细胞有保护作用，但是脂溶性的(NAC)能穿过细胞膜，其对细菌的保护效果要优于(SOD)和(AA)。结果表明，PYO对于食源细菌生长的抑制主要基于其氧化活性所产生的活性氧自由基。
　　3.采用SWV方法实时在线检测了不同培养体系（LB、NB和NaCl）菌膜以及培养体系中不同时间（3天和6天，设置对照组）PYO的变化，同时采用结晶紫染色显微观察法对菌膜形态进行观察，结果表明，PYO对铜绿假单胞菌菌膜的形成具有促进作用，PYO含量越高，铜绿假单胞菌越容易形成菌膜;营养物质充足的缺氧环境中容易促进菌膜的形成;极度恶劣的环境条件下（NaCl体系），铜绿假单胞菌主要是以菌膜的形式存在。由此可知，PYO在铜绿假单胞菌菌膜形成和发展中具有重要作用，初步推测作为电子载体参与菌膜内细胞电子传递，为细菌持续提供能量，对维持细菌代谢以及菌膜稳定起到重要作用。研究结果表明，SECM在实现生物体系氧化还原信息的实时、原位、无损以及在线分析方面具有独特优势，有望为食品工业探索阻断菌膜形成的新靶标提供技术支撑。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 食源性细菌的简介

1．2 绿脓菌素

1．2．1 绿脓菌素作为毒力因子

1．2．2 绿脓菌素作为信号分子

1．3 生物被膜

1．3．1 生物被膜的结构

1．3．2 生物被膜研究现状

1．4 扫描电化学显微镜简介

1．4．1 SECM的实验装置

1．4．2 SECM的基本原理

1．4．3 SECM的工作模式

1．4．4 SECM扫描图示

1．5 本论文研究目的、意义和内容

1．5．1 本研究目的和意义

1．5．2 研究的主要内容

2 绿脓菌素在铜绿假单胞菌生长过程中变化规律的研究

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验主要试剂

2．2．2 实验主要菌种

2．2．3 实验主要仪器

2．2．4 实验步骤与方法

2．3 实验结果

2．3．1 绿脓菌素最大吸收波长的测定以及标准曲线的测定

2．3．2 绿脓菌素在铜绿假单胞菌生长过程中的作用及变化

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 绿脓菌素对食源细菌生长影响的研究

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．2 实验菌种

3．2．3 实验仪器

3．2．4 实验步骤与方法

3．3 实验结果

3．3．1 不同浓度绿脓菌素对3种食源细菌生长的影响

3．3．2 外源抗氧化试剂对绿脓菌素介导的大肠杆菌生长影响

3．4 讨论

3．4．1 不同浓度绿脓菌素对3种食源细菌生长的影响

3．4．2 外源抗氧化试剂对绿脓菌素介导的大肠杆菌生长影响

3．5 小结

4 PYO对不同体系连续培养的铜绿假单胞菌成膜影响研究

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 实验主要试剂

4．2．2 实验主要菌种

4．2．3 实验主要仪器

4．2．4 实验步骤与方法

4．3 实验结果

4．3．1 铜绿假单胞菌在不同溶液体系连续培养过程中成膜相关研究

4．3．2 NaCl体系中添加绿脓菌素连续培养绿脓杆菌菌膜的研究

4．4 讨论

4．5 小结

5 总结

5．1 总结与展望

5．2 创新点

参考文献

附录

致谢