乳清浓缩蛋白纳米纤维的制备及其性质研究

摘要

目前关于单一蛋白β-乳球蛋白和乳清分离蛋白(WPI)在非常规条件下制各的纤维特性已有不少研究。而对于成分相对复杂的乳清浓缩蛋白(WPC)在非常规条件下，形成的特殊结构——纳米纤维，以及所具有的独特性质则少有报道。因此本课题主要研究纳米纤维的制备条件（蛋白浓度、pH和热处理时间），分析了纳米纤维的主要作用力（游离巯基、表面疏水性）、特性（浊度、ThT、DSC、表观粘度、蛋白组成），酸可逆性、功能性质（胶凝性、起泡性、乳化性）的变化。乳清浓缩蛋白纳米纤维具有的特性，有可能使其成为独特的乳蛋白基料，对拓展或改善乳蛋白的应用领域有积极意义。主要研究结果分述如下:
　　 纳米纤维的制备条件及其影响因素通过透射电镜(TEM)分析，在pH1.8条件下，蛋白浓度为3.0wt％的WPC溶液，在90℃下热处理10h可形成纳米纤维结构，分析蛋白浓度、pH、以及热处理时间对纳米纤维形成的影响。结果发现随着蛋白浓度、pH的增加，形成的纳米纤维就越粗，分支处的聚合物较多，若蛋白浓度和pH过低，其形成的纳米纤维过细，状态不明显，因此蛋白浓度为3.0 wt％的WPC溶液在pH1.8条件下适宜形成纳米纤维。此外，随着热处理时间的延长，纳米纤维分支处的聚合物减少，纤维状态越清晰，当乳清浓缩蛋白在90℃下加热至10h时，可形成细长、形态良好的纳米纤维结构。
　　 主要作用力通过对纳米纤维的表面疏水性、游离巯基的研究表明，纳米纤维和常规乳清浓缩蛋白聚合物的表面疏水性含量分别为93.46±2.23和71.62±1.59，游离巯基含量从最初的22706.6(μmol/L)和21014（μmoL/L）分别下降到16606.66(μmol/L)和2325.19±59.01(μmoL/L)，由此可见，在纳米纤维的形成过程中，表面疏水性起主要作用而二硫键作用比较微弱。
　　 特性通过对浊度、ThT、表观粘度、DSC以及蛋白组成的研究表明，乳清浓缩蛋白通过热聚合形成的纳米纤维，拥有比常规乳清浓缩蛋白聚合物更低的浊度值、表观粘度和更高的变性温度，二种聚合物在形成过程中蛋白质结构变化也有所不同。并且分析了两种聚合物之间聚合量和蛋白组成的差异，纳米纤维和常规乳清浓缩蛋白聚合物的聚合量分别分0.167±0.006g/L和0.786±0.011g/L，可见纳米纤维的聚合量明显低于常规乳清浓缩蛋白聚合物的聚合量。通过SDS-PAGE凝胶电泳研究表明，纳米纤维的蛋白质组成与常规聚合物存在一定差异，形成纳米纤维聚合物的蛋白质存在一定的酸水解作用。
　　 酸可逆性纳米纤维在pH1.8与pH6.5之间反复调节pH及二次热处理，通过对其微观结构、浊度、聚合量、游离巯基、表面疏水性及二级结构的研究表明，纳米纤维结构具有酸可逆性，在pH1.8和6.5之间多次调整，仍可以在pH1.8恢复纤维结构，并且恢复之后的纤维结构仍具有很好的热稳定性。二次热处理后纳米纤维的聚合量有一定增加，二硫键数目略有增加，表面疏水性作用进一步增强导致纳米纤维形成更多的枝杈结构。通过对ThT、CD研究表明，二次热处理后乳清蛋白α-螺旋结构的进一步减少可能使纤维形成量略有增加。基于酸可逆模型，猜测酸可逆主要是非共价键的部分断开，二硫键产生的少量聚合和未解聚纤维以碎片的形式分散在pH6.5的介质中，这些碎片通过疏水作用聚合成大的聚合物，当pH再次降至1.8时，以非共价键聚合的大聚合物解离重新形成纤维，只是这种解离并不完全，导致酸可逆之后形成的纤维有较多枝杈，形成淀粉样纤维特征;当调回pH6.5时再次的热处理会使其丧失再次形成纤维的能力，其原因主要是蛋白质分子之间形成了太多的共价键（二硫键），这种纤维碎片之间的聚合不会因再次调回pH1.8而再次解聚，因而无法再次恢复纤维结构。除此之外，我们分析了离子强度对纳米纤维酸可逆性的影响，通过透射电镜(TEM)分析，随着Ca2+浓度的增加，纳米纤维变短、呈蠕虫状，最后纤维结构被破坏，呈团簇状聚合;Na+浓度的增加，纳米纤维开始保持良好的状态，随后逐渐变短、变粗，呈蠕虫状聚合;当Ca2+浓度为10mM及Na+浓度为20mM时，可保持良好的纳米纤维结构。通过对ThT的研究表明，Ca2+存在时纳米纤维的酸可逆性较差，而Na+存在时纳米纤维具有较好的酸可逆性。
　　 功能性质通过对胶凝性的研究表明，添加乳清浓缩蛋白对酸奶凝胶有强化作用，纳米纤维添加量低对酸奶凝胶的影响不大，而添加高含量纳米纤维对酸奶凝胶起到负面作用。添加纳米纤维的酸奶凝胶的硬度、黏度，随着蛋白添加量的增加而减小;添加0.15～0.30wt％纳米纤维的硬度和粘度稍有降低，酸奶凝胶组织状态较紧实，没有乳清析出;添加0.45～0.6wt％纳米纤维的酸奶凝胶的硬度和粘度明显降低，而且酸奶的凝胶组织状态不紧实，伴有部分乳清的析出，酸奶凝胶的网络结构疏松、空隙不均匀。
　　 通过对起泡性和乳化性的研究表明，与常规乳清浓缩蛋白聚合物相比，纳米纤维具有较好的乳化稳定性，当静置30 min后，纳米纤维的乳化稳定性提高了20％，尤其在起泡能力和泡沫稳定性方面，明显高于乳清浓缩蛋白常规聚合物，其中，起泡能力增加了2.4倍，泡沫稳定性是乳清浓缩蛋白常规聚合物的2.96倍。并且酸可逆性处理过程中，二次加热后的纳米纤维溶液起泡能力和泡沫稳定性最强，分别是纳米纤维原样的1.17倍和1.54倍;其乳化活性和乳化稳定性也最强，分别是纳米纤维原样的1.11倍和1.25倍。纳米纤维聚合物在起泡性能方面的表现优于乳化性能，相对于常规聚合物而言，纳米纤维的这种特殊结构更有利于改善乳清浓缩蛋白的界面性质。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 乳清蛋白概述

1．1．1 乳清蛋白的组成

1．1．2 乳清蛋白的结构

1．2 热处理对乳清蛋白的影响

1．3 pH对乳清蛋白的影响

1．4 乳清蛋白纳米纤维研究进展

1．5 课题研究的意义及主要内容

1．5．1 研究的目的和意义

1．5．2 研究的主要内容

2．材料与方法

2．1 原料设备

2．1．1 原料

2．1．2 药品

2．1．3 主要试验仪器和设备

2．2 试验方法

2．2．1 原料成分的测定

2．2．2 样品的制备

2．2．3 透射电镜

2．2．4 蛋白聚合量

2．2．5 硫磺素-T荧光强度的测定(ThT)

2．2．6 酸可逆处理

2．2．7 离子强度对酸可逆性影响的测定

2．2．8 表面疏水性

2．2．9 圆二色光谱(CD)

2．2．10 DSC测定

2．2．11 游离巯基

2．2．12 浊度

2．2．13 起泡性

2．2．14 乳化性

2．2．15 表观粘度

2．2．16 SDS-PAGE凝胶电泳

2．2．17 酸奶的制作工艺

2．2．18 酸奶质地的测定

2．2．19 酸奶凝胶微观结构的测定

2．3 统计方法

3 结果与分析

3．1 纳米纤维的制备

3．1．1 蛋白质浓度对纳米纤维的影响

3．1．2 pH对纳米纤维的影响

3．1．3 热处理时间对纳米纤维的影响

3．2 纳米纤维形成的主要作用力

3．2．1 表面疏水性

3．2．2 游离巯基

3．3 纳米纤维的主要特性

3．3．1 浊度

3．3．2 硫磺素-T荧光强度(ThT)

3．3．3 表观粘度

3．3．4 DSC试验

3．3．5 聚合量与蛋白质组成

3．4 纳米纤维的酸可逆性

3．4．1 酸可逆性

3．4．2 浊度的变化

3．4．3 聚合量的变化

3．4．4 游离巯基的变化

3．4．5 表面疏水性的变化

3．4．6 二级结构的变化

3．4．7 酸可逆模型

3．4．8 离子强度对纳米纤维酸可逆性的影响

3．5 纳米纤维的功能性质

3．5．1 胶凝性

3．5．2 起泡性

3．5．3 乳化性

4 讨论

4．1 乳清浓缩蛋白纳米纤维的形成条件

4．2 纳米纤维的主要特性

4．3 纳米纤维的酸可逆性

4．4 纳米纤维的功能性质

5 结论

5．1 纳米纤维的制备条件及其影响因素

5．2 纳米纤维的主要作用力

5．3 纳米纤维的主要特性

5．4 纳米纤维的酸可逆性

5．5 纳米纤维的功能性质

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文