基于高通量测序研究陈皮提取物对高脂饮食小鼠肠道菌群的影响

摘要

随着生活水平的提高，肥胖、高血压、糖尿病等代谢性疾病发病率大幅增长，已成为严重影响人民群众健康水平的公共卫生问题。研究和开发具有良好降脂和减重作用的功能性食品是目前关注的热点。新近研究结果指出，肠道菌群可与宿主、饮食等相互作用，参与调节宿主的能量吸收及营养代谢，是治疗和预防高脂肥胖症的“新靶点”。陈皮在我国中药医学中被广泛应用并且历史悠久。陈皮富含橙皮苷、挥发油、黄酮类等活性物质，具有缓解慢性炎症、降低血糖及控制体重的功效。本研究前期工作也初步证实，使用连续相变萃取技术提取出来的陈皮油，可有效调节由高脂饮食引起的糖代谢或者脂代谢紊乱，但尚不清楚陈皮能否能调节高脂膳食引发的肠道菌群失衡。因此，本实验拟借助宏基因组技术探究陈皮提取物对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的肠道菌群平衡的影响，对未来研究肥胖、陈皮提取物与肠道菌群的关系提供理论依据。
　　本研究主要内容包括：⑴将4周龄昆明雌性小鼠随机分为正常组、高脂组、辛伐他汀组(2 mg/kg/d)、陈皮提取物高剂量组(10g/kg/d)、陈皮提取物低剂量组(5g/kg/d)，每组8只，每天观察小鼠体重变化和相关的肥胖指数，并监测小鼠血清中血脂四项、血糖水平、脂蛋白脂酶和肝脂酶活性，以探究陈皮提取物降脂的作用。结果显示:与正常组比较，高脂组小鼠体重显著增加，血清中的胆固醇和低密度脂蛋白含量显著升高(P＜0.05)，而血清脂蛋白脂酶和肝脂酶水平降低。而不同剂量陈皮提取物或药物辛伐他汀干预，均可在一定程度上抑制小鼠肥胖。与高脂组比较，陈皮各剂量组小鼠体重减轻，血清中胆固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白的含量显著降低(P＜0.05)，促进小鼠血清脂蛋白脂酶、肝脂酶活性提高，并具有剂量依赖性。且药物辛伐他汀组的降脂效果优于陈皮提取物组。⑵基于Illumina MiSeq测序平台对高脂小鼠粪便DNA的V3-V4区进行高通量测序，分析陈皮提取物对高脂饮食小鼠肠道菌群多样性的影响。经过OTU聚类分析，五组小鼠15个粪便样品共得到427080条合格的序列。稀释性曲线和等级丰度曲线代表了肠道菌群结构的多样性和均匀度。由结果可知，高脂饮食组小鼠肠道菌群多样性降低。辛伐他汀组与陈皮高剂量组曲线的平缓程度更接近正常组，说明经过陈皮提取物的干预，肠道菌群多样性发生变化。alpha多样性指数与物种累积曲线结果提示，陈皮提取物干预后提高了高脂小鼠肠道菌群结构的多样性和丰度。韦恩图和heatmap热图代表了五组样品间的相似度，结果显示高脂组小鼠与正常组的粪便菌群特征有明显差异，正常组OTUs数量为364，正常组和高脂组共有的OTUs数量降为196个。而陈皮提取物高剂量组和正常组共有的OTUs数量增加到242个，说明陈皮提取物干预可以提高肠道菌群的相似度。正常组小鼠组粪便中，厚壁杆菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)所占比例分别为肠道细菌总量的46.66％和50.09％，变形菌门(Proteobacteria)则占2.56％。与正常组比较，高脂组小鼠肠道中厚壁菌和拟杆菌门的仍属优势菌，但厚壁菌门的数量相对增加(62.28％ vs50.09％，P＜0.05)，拟杆菌门的数量相对减少(50.09％ vs34.95％)。辛伐他汀治疗组小鼠肠道菌群紊乱，也具有厚壁菌门数量增加，拟杆菌门数量减少（约占20％）的趋势。与高脂组相比，陈皮提取物干预可显著降低小鼠肠道中厚壁菌门数量(P＜0.05），与正常组比较差异不显著(P＞0.05），并在一定程度上促进拟杆菌门数量升高(34.95％ vs25.90％)。与正常组相比，高脂组小鼠肠道中(Lachnospiraceae)毛螺旋菌科(38％ vs25.53％)和Bacteroidales_S24-7_group(35％ vs7.99％)所占比例均显著降低(P＜0.05），而瘤胃菌科(29.71％ vs6.88％)和(Rikenellaceae)理研菌科(19.87％ vs2.73％)的比例显著升高(P＜0.05)。与高脂组相比，经辛伐他汀组药物治疗后小鼠肠道的毛螺旋菌科的比例显著上升（41.65％ vs25.53％，P＜0.05），几乎恢复到至正常组水平。而理研菌科的比例显著下降（19.87％ vs8.13％，P＜0.05）。经过陈皮提取物的干预后，毛螺旋菌科几乎可以恢复到正常水平。⑶高脂饮食破坏小鼠肠道微生态环境，辛伐他汀组药物治疗虽有效降低了血脂血糖指标，但不能改善肠道菌群紊乱状态。而陈皮提取物干预不仅可以缓解肥胖的症状，同时调节了肠道菌群失衡，具体表现在小鼠肠道菌群的多样性指数升高和组成结构变化。

目录

声明

摘要

1 前言

1．2．1 人体肠道菌群的概述

1．2．2 人体肠道菌群与肥胖的关系

1．3 陈皮的研究进展

1．3．1 陈皮提取物的研究进展

1．3．2 陈皮在病症中的作用

1．4 研究生物多样性方法的研究进展

1．4．1 单菌分离培养

1．4．2 分子生物学方法

1．4．3 高通量测序时代

1．4．4 高通量测序在肠道菌群中的应用

1．5 本研究的目的与意义

1．6 本研究拟采用的技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂及来源

2．2 仪器和设备

2．3 试验方法

2．3．1 陈皮提取物的制备

2．3．2 动物模型的建立

2．3．3 陈皮提取物对高脂小鼠的影响

2．3．4 统计学处理方法

3 结果分析

3．1 陈皮提取物对小鼠体重与脂肪指数的影响

3．1．1 体重变化

3．1．2 指数变化

3．2 陈皮提取物对小鼠血液生化指标的影响

3．2．1 血脂四项变化

3．2．2 血糖的变化

3．3 陈皮提取物对小鼠血清相关脂肪酶的影响

3．3．1 陈皮提取物对小鼠肝脂酶活性的影响

3．3．2 陈皮提取物对小鼠血清脂蛋白酯酶活性的影响

3．4 平板计数法对肠道菌群的研究

3．5 组织形态学观察

3．5．1 肝脏病理改变

3．5．2 结肠病理改变

3．6 高通量测序结果分析

3．6．3 Rank-abundance曲线

3．6．4 稀释性曲线

3．6．5 Shannon-Wiener曲线

3．6．6 Specaccum物种累积曲线

3．6．7 alpha多样性指数

3．6．8 韦恩图分析

3．6．9 Core microbiome分析

3．6．10 物种组成成分分析

3．6．11 菌群结构及相似度比较分析

3．6．12 Heatmap分析

4 讨论

4．1 陈皮提取物对血脂血糖的影响

4．2 陈皮提取物对肠道菌群结构的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文