基于高通量测序研究肉桂精油对肠炎小鼠肠道菌群的影响

摘要

目前众多研究显示，炎症性肠病(IBD)的基础病因可能与肠道菌群紊乱破坏肠道耐受性而引发的过度炎症密切相关。研究肠道菌群的作用是肠炎靶标研究方向，肉桂精油是肉桂的挥发油提取物，它具有抑制致病菌生长的作用，而炎症性肠病又与人体肠道微生物失衡有关。而肉桂精油能否对肠道菌群失衡引起的炎症性肠病有治疗作用尚不清楚。鉴于此，本试验以前期试验证实亚临界水提取的具有功效的肉桂精油为研究对象，通过构建肠炎小鼠模型，对肠炎小鼠体重改变，结肠长度和病理学组织，髓过氧化物酶(MPO)活力，血红蛋白含量及免疫器官指数的检测，说明肉桂精油的作用。进而基于Illumina MiSeq测序平台的高通量测序技术分析各组小鼠粪便DNA V3-V4区，深入剖析肉桂精油对肠炎小鼠菌群的影响。研究结果将从肠道菌群角度揭示肉桂精油减轻肠炎的作用机理，为肠炎治疗提供新的治疗靶点。
　　本研究主要内容包括：⑴从小鼠体征指标变化角度研究肉桂精油对炎症性肠病的缓解作用。5-6周昆明雌性小鼠随机分为正常组、抗生素组（头孢曲松钠10 mg/kg/d）、肠炎组(3％ DSS)和肉桂精油组(高剂量组15 g/kg，低剂量组10 g/kg，sigma组10 g/kg)，每组6只。每天观察小鼠体重和体征变化，进行DAI评分。造模结束后，测量小鼠结肠长度，进行病理学组织分析，检测髓过氧化物酶(MPO)活力，取胸腺和脾脏检测免疫器官指数，眼球取血检测血红蛋白含量变化。肉桂精油缓解了DSS造成的小鼠体重减轻，结肠损伤，髓过氧化物酶(MPO)活力升高，脾脏指数提高，胸腺指数和结肠指数下降，血红蛋白含量降低等症状。与肠炎组对比，肉桂精油高剂量组效果显著，DAI指数降低了3倍，结肠长度增加了约16％，髓过氧化物酶(MPO)活力降低了一倍，肉桂精油低剂量组和sigma组MPO值明显下降。抗生素作为常规肠炎治疗药物，对炎症性肠病也具有缓解作用，结肠长度显著增加(45.33 vs63.87，P＜0.05)，MPO指数显著降低(1.33 vs0.57，P＜0.05)。⑵基于Illumina MiSeq测序平台对小鼠粪便DNA的V3-V4区进行高通量测序，分析肠道菌群多样性的变化。在门水平上，正常组小鼠中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主要优势菌，分别占据了肠道细菌总量的48.77％和48.03％，其次包括变形菌门（Proteobacteria）(2.52％)。与正常组比较，DSS诱导小鼠粪便中Firmicutes和Bacteroidetes的优势菌地位虽然没变，但厚壁菌门减少，拟杆菌门增加，变形菌门数量发生了显著变化，总量比正常组高4.3倍，占据肠道总体细菌数量的10.76％。经肉桂精油治疗后，肠炎组小鼠肠道整体菌群结构发生明显差异，拟杆菌门和变形菌门均减少，厚壁菌门数量增加，其中肉桂精油高剂量组效果显著，变形菌门(10.76％ vs0.56％，P＜0.05)显著减少。在科水平上，经肉桂精油治疗后，拟杆菌科数量明显接近正常水平，与肠炎组对比，S24-7科含量明显上升，其中高剂量组和低剂量组(44.06％ vs27.7％，P＜0.05)治疗效果表现出明显的差异性。⑶通过LEfSe进一步分析各组小鼠肠道菌群，结果发现，与正常组相比，肠炎组小鼠梭菌目（Clostridiales）中的拟杆菌种（Bacteroidales_S24-7_group）明显降低(32％ vs21％，P＜0.05)，拟杆菌目中的毛螺菌种（Lachnospiraceae_NK4A136_group）显著下降（29％ vs13％，P＜0.05）。经肉桂精油治疗后，各菌种恢复正常水平。研究证实炎症性肠病与肠道菌群失调密切相关，而肉桂精油可缓解肠道微生物紊乱，提高肠道微生物丰度，通过提高小鼠肠道群落结构多样性，维持肠道内环境稳态，起到预防并改善炎症性肠病的效果，为未来炎症性肠病的缓解和治疗方式提供了新的方向。

目录

声明

摘要

1．前言

1．2．1 炎症性肠病的发病机制

1．2．2 肠道菌群紊乱对炎症性肠病的影响

1．3 肉桂精油治疗炎症性肠病的研究进展

1．3．1 肉桂精油的提取工艺

1．3．2 肉桂精油的抑菌性能

1．3．3 肉桂精油调节肠道菌群失衡

1．4 高通量测序技术研究进展

1．4．1 分子生物技术的发展

1．4．2 高通量测序技术在肠道菌群中的研究进展

1．5 研究目的与意义

1．6 本研究拟采取的技术路线

2．材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 供试药物

2．1．2 试验动物

2．2 主要材料与设备

2．2．1 试剂及来源

2．2．2 仪器及来源

2．3 动物模型的构建

2．4 一般状态的观察

2．5 DAI评分

2．6 HE染色

2．7 免疫器官指数

2．8 血红蛋白检测

2．9 结肠组织髓过氧化(MPO)活性的变化

2．10 高通量测序法测定肠道菌群变化

2．10．2 肠道菌群16S rDNA V3区PCR扩增

2．10．3 Illumina MiSeq300高通量测序

3．结果与讨论

3．1 肉桂精油对小鼠结肠炎的治疗作用

3．1．1 肉桂精油对肠炎小鼠体重的影响

3．1．2 肉桂精油对DSS模型小鼠结肠长度影响

3．1．3 肉桂精油对肠炎小鼠结肠组织损伤的影响

3．1．4 肉桂精油对肠炎小鼠DAI评分的影响

3．1．5 肉桂精油对肠炎小鼠结肠组织MPO值的影响

3．1．6 肉桂精油对肠炎小鼠免疫器官指数的影响

3．1．7 肉桂精油对肠炎小鼠血红蛋白含量变化的影响

3．2 基于高通量研究肉桂精油对肠炎小鼠肠道菌群的影响

3．2．1 OTU分类结果

3．2．2 肉桂精油对小鼠肠道菌群多样性和丰富度的影响

3．2．3 Alpha多样性指数

3．2．4 肉桂精油对小鼠肠道菌群相似度的影响

3．2．5 肉桂精油对小鼠肠道菌群结构组成的影响

3．2．6 肉桂精油对炎症性肠病特定菌群类型的作用

4．讨论

4．1 肉桂精油对小鼠炎症性肠病的缓解作用

4．2 肉桂精油对肠炎小鼠肠道菌群的影响

4．2．1 肉桂精油对肠炎小鼠肠道菌群丰富度的影响

4．2．2 肉桂精油对肠炎小鼠肠道菌群结构组成的影响

5．结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文