美拉德反应对鱼类小清蛋白免疫学性质及结构的影响

摘要

鱼类是常见的过敏食物，我国作为鱼类生产及消费大国，由鱼类引起的食物过敏问题不容忽视。小清蛋白（Parvalbumin，PV）是鱼类主要过敏原。随着对鱼类过敏原性质研究的深入，通过加工处理消减鱼类过敏原的致敏性，开发低致敏性鱼类制品将具有重要的意义。美拉德反应是食品加工中广泛存在的反应，不仅促进食品风味，改善食品色泽，对食物过敏原的免疫活性也有一定的影响。本研究拟建立并优化鱼类主要过敏原 PV美拉德反应的条件，并分析美拉德反应对 PV的免疫学性质、消化稳定性及结构的影响，以期为开发低致敏性鱼类食品提供一定的理论依据。
　　利用构建的重组PV（Recombinant Parvalbumin，rPV）表达菌株[BL21/pET-28a-PV]，表达纯化出 rPV；以糖种类、糖添加量、反应时间为变量，以反应产物的聚合情况及褐变度为监测指标，优化了rPV的美拉德反应条件：rPV:葡萄糖/木糖（w/w）=1:8，100°C条件下反应100 min。对rPV美拉德产物性质的分析结果显示，美拉德反应后rPV的含糖量、荧光强度均明显增加；Dot blotting分析表明，美拉德反应降低了rPV的IgG结合活性。采用QE-MS/MS分析表明，在该反应条件下rPV的第55、84、88、97、108位赖氨酸残基发生了糖化修饰，其中第88、97、108位赖氨酸残基位于IgE结合表位区域，连接在赖氨酸残基上的糖链可能对表位产生直接的封闭效应，从而降低了小清蛋白的致敏性。圆二色谱分析结果表明，美拉德反应后rPV无规则卷曲的百分含量降低；ANS疏水性荧光探针检测结果显示美拉德反应后rPV疏水性增加；扫描电镜结果显示，糖化后的rPV互相交联形成网络结构，这些蛋白结构的改变可能也是影响rPV免疫活性的重要原因之一。
　　利用rPV优化的美拉德反应条件，进一步研究糖化对天然小清蛋白免疫活性及结构的影响。以厦门产海洋鱼类灰星鲨（Mustelus griseus）为研究对象，利用硫酸铵盐析及连续柱层析（DEAE-Sepharose、Sephacryl S-200 HR）从灰星鲨鱼肉中分离纯化得到分子量分别为14 kDa和12 kDa两个亚型的小清蛋白（SPVI，SPVII）。分别对其在蛋白:葡萄糖（w/w）=1:8，100°C条件下反应100 min进行美拉德反应。美拉德反应后SPVI、SPVII的IgG结合活性均降低，消化稳定性增加，二级结构部分丧失，疏水性增加。进一步采用RBL-2H3细胞模型评价美拉德反应对 SPVs致敏性的影响，通过测定脱颗粒情况以及组胺、IL-4、TNF-α的分泌量变化，证实美拉德反应可降低SPVs的免疫活性。
　　在此基础上，利用美拉德反应结合高压处理制备低致敏性鲨鱼鱼松。Dot blotting分析表明，与对照组相比，采用高压结合美拉德反应制备的鲨鱼鱼松IgG结合活性基本消失。采用Balb/c小鼠致敏模型证实，高压处理结合美拉德反应制备的鲨鱼鱼松与对照组相比，可以减轻小鼠过敏症状、减缓直肠温度下降并抑制Th2脾脏淋巴细胞细胞因子分泌，表明采用高压结合美拉德反应制备的鲨鱼鱼松具有较低的致敏性。

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第1章 绪论

1.1 食物过敏及其致敏机制

1.2 鱼类主要过敏原——PV

1.3 食物过敏原致敏性的消减

1.4 本研究的目的及意义

第2章 rPV美拉德反应条件建立及性质分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 SPVs的纯化及美拉德反应对其性质的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第4章 低致敏性鲨鱼鱼松的制备

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

致谢

参考文献

在学期间发表的取得的科研成果