一种谷糠膳食纤维及其制备的预防溃疡性结肠炎的膳食纤维代餐粉

摘要

本发明属食品深加工技术领域，为解决目前谷糠利用率不高、谷糠中活性成分浪费等问题，提供一种谷糠膳食纤维及其制备的预防溃疡性结肠炎的膳食纤维代餐粉。谷糠粉碎后石油醚脱脂，水浴加热糊化淀粉，依次进行α‑淀粉酶酶解、木瓜蛋白酶酶解蛋白，高温灭活酶后，抽滤，将抽滤后所得残渣洗涤得到不溶性膳食纤维，抽滤后所得滤液乙醇沉淀、洗涤获得可溶性膳食纤维，将不溶性膳食纤维与可溶性膳食纤维混合即为预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维；可以促进肠道蠕动、缩短排便时间、调节肠道菌群失调，可以预防溃疡性结肠炎，减轻结肠长度缩短、结肠炎症和肠道屏障受损情况，还能调节肠道菌群失调，提高菌落的丰富度和均匀度，具有一定的促进肠道健康作用。

说明书

技术领域

本发明属于食品深加工技术领域，具体涉及一种谷糠膳食纤维及其制备的预防溃疡性结肠炎的膳食纤维代餐粉。

背景技术

粟（又称谷子），禾本科植物，是中国的主要粮食作物之一。谷子的果实为颖果，一般脱去谷壳以供食用。谷糠是谷子在碾米过程中产生的副产物，包含谷皮、糊粉层和部分胚芽。相比于精制谷物，谷糠含有更多的活性成分，包括膳食纤维DF、多糖、多肽、谷维素、多酚、植酸、维生素及微量元素等，具有抗炎、抗癌、抗菌和抗衰老等药理活性。膳食纤维DF是谷糠的主要成分，约占谷糠的60%，而不溶性膳食纤维IDF是谷糠DF的主要部分，约占谷糠总DF的86%。水溶性膳食纤维SDF的含量是评价DF品质的指标之一，因其可以形成凝胶且其生理功能和营养价值优于IDF。

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）是一种病因和发病机制尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病，甚至是终身疾病。UC是一种导致结肠和直肠内壁炎症的慢性炎症性肠病，临床症状表现为便血、腹泻等症状，由遗传因素、肠道屏障损伤、免疫失调和环境因素等多种因素诱发。目前DF与肠道健康的相关研究多集中在DF对肠炎、肠癌的治疗方面，而DF对肠炎的预防作用研究较少。大量研究肯定了DF促进肠道健康的积极作用，但没有系统全面的评价膳食纤维预防肠炎的具体作用以及探讨相关机制。

目前谷糠除了作为动物饲料外，大多被废弃，导致谷糠的利用率不高，造成谷糠中活性成分的浪费。相比于米糠，谷糠的研究尚显不足，仍需深入并全面研究其活性成分的具体生理活性。

发明内容

本发明为了解决目前谷糠利用率不高、谷糠中活性成分浪费等问题，提供了一种谷糠膳食纤维及其制备的预防溃疡性结肠炎的膳食纤维代餐粉。

本发明由如下技术方案实现的：一种预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维，谷糠粉碎后石油醚脱脂，水浴加热糊化淀粉，然后依次进行α-淀粉酶酶解、木瓜蛋白酶酶解蛋白，高温灭活酶后，抽滤，将抽滤后所得残渣洗涤得到不溶性膳食纤维，抽滤后所得滤液乙醇沉淀、洗涤获得可溶性膳食纤维，然后将得到的不溶性膳食纤维与可溶性膳食纤维混合即为预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维；

其中：α-淀粉酶酶解条件为：α-淀粉酶的加酶量250-350 U/g，酶解温度70-80℃，酶解pH 6.5-7.5，酶解时间2.0-3.0 h；木瓜蛋白酶的酶解条件为：木瓜蛋白酶的加酶量100-200 U/g，酶解温度50-60℃，酶解pH 6.5-7.5，酶解时间1.5-2.5 h。

制备所述预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维的方法，具体步骤如下：

（1）脱脂：谷糠粉碎至100目，按料液比为1：4g/mL加入石油醚浸泡30min，抽滤，重复浸泡3次，水浴上挥去残留的石油醚，干燥得脱脂谷糠粉；

（2）酶解淀粉：按料液比1：25加蒸馏水，95℃下水浴加热20min，使淀粉糊化，加入α-淀粉酶进行酶解淀粉，酶解淀粉结束后，100℃加热10min灭酶活，冷却；

（3）酶解蛋白：加入木瓜蛋白酶酶解蛋白，酶解蛋白结束后，100℃加热10min灭酶活，抽滤，得残渣和滤液；

（4）不溶性膳食纤维的获得：步骤（3）所得残渣用70℃蒸馏水洗涤，依次用体积浓度为78%的乙醇、95%的乙醇、丙酮洗涤，60℃干燥，得不溶性膳食纤维；

（5）可溶性膳食纤维的获得：合并步骤（3）中的滤液和步骤（4）中的蒸馏水洗涤液，旋蒸浓缩，加入浓缩液4倍体积的预热至60℃的95%乙醇，室温下沉淀1h，倾去上清液，依次用78%乙醇，95%乙醇，丙酮洗涤，冷冻干燥12h即为可溶性膳食纤维；

（6）预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维的获得：步骤（4）所得不溶性膳食纤维余步骤（5）所得可溶性膳食纤维混合即为预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维。

所述α-淀粉酶酶解条件为：α-淀粉酶的加酶量350 U/g，酶解温度70℃，酶解pH7.0，酶解时间2.5 h；木瓜蛋白酶的酶解条件为：木瓜蛋白酶的加酶量100 U/g，酶解温度60℃，酶解pH 7.0，酶解时间1.5 h。

一种预防溃疡性结肠炎的膳食纤维代餐粉，其中膳食纤维为上述预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维或者利用所述方法制备的预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维，由如下重量份的原料制成：谷糠膳食纤维20-35，黄芪粉8-13，山药粉8-13，黄豆粉12-25，苦荞粉12-20，玉米粉8-12，果蔬粉8-15，甜蜜素0.03-0.06；所述果蔬粉为苹果冻干粉、西柚冻干粉、黄瓜冻干粉中的一种任意两种以任意比例混合的混合粉。

本发明通过加深对谷糠及其活性成分的研究，研制出谷糠膳食纤维代餐粉，并评价其对肠炎的预防作用，以提高谷糠的产品附加值。所制备的谷糠膳食纤维的持水力为1.70 g/g，持油力为1.94 g/g，膨胀力为0.96 mL/g；可显著缩短正常小鼠的胃肠通过时间，一定程度上预防溃疡性结肠炎小鼠的肠道微生物的多样性下降，具有一定促进肠道健康的作用。

避免了对膳食纤维结构的破坏，减少了废水处理成本和环境污染。以谷糠为原料制备膳食纤维，成本低廉，并促进了谷糠的深度加工利用。谷糠膳食纤维具有持水力、持油力和膨胀力，还具有缩短胃肠通过时间、调节肠道菌群的功能，具有应用于食品加工及功能食品中的潜力。所制备的代餐粉富含膳食纤维及多种营养活性成分，保证了人体对膳食纤维及其他基本营养成分的摄入，可以促进肠道蠕动、缩短排便时间、调节肠道菌群失调，可以预防溃疡性结肠炎，减轻结肠长度缩短、结肠炎症和肠道屏障受损情况，还能调节肠道菌群失调，提高菌落的丰富度和均匀度，具有一定的促进肠道健康作用。

附图说明

图1为α-淀粉酶单因素试验结果图；图中：A为加酶量对还原糖含量的影响；B为酶解时间对还原糖含量的影响；C为酶解pH对还原糖含量的影响；D为酶解温度对还原糖含量的影响；图2为木瓜蛋白酶单因素试验结果；图中：A为加酶量对综合指标的影响；B为酶解时间对综合指标的影响；C为酶解pH对综合指标的影响；D为酶解温度对综合指标的影响；图3为各组小鼠DAI评分，与C组相比，

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。

一、谷糠膳食纤维提取工艺优化及其单糖组成、物化特性研究

1、谷糠膳食纤维提取工艺优化：谷糠粉碎，过100目筛，按1：4（g/mL）加入石油醚浸泡30 min，抽滤，重复浸泡3次以脱脂。滤过的谷糠置于水浴锅上挥去残留的石油醚，干燥即得脱脂谷糠。

谷糠膳食纤维制备工艺流程：称取脱脂谷糠5.00 g，精密称定，按料液比1：25（g/mL）加入蒸馏水，置于水浴锅中糊化（95℃，20 min），经α-淀粉酶酶解，灭活（100℃，10min），再经木瓜蛋白酶酶解，灭活（100℃，10 min），抽滤，残渣用70℃热水洗涤，合并滤液用于测定SDF。残渣依次用78%乙醇，95%乙醇，丙酮洗涤，烘干（105℃，5h），即得IDF。滤液浓缩后，加入4倍体积的预热至60℃的95%乙醇，室温下沉淀1h，倾去上清液，依次用78%乙醇，95%乙醇，丙酮洗涤，冷冻干燥，即得SDF。

2、α-淀粉酶提取谷糠膳食纤维的正交试验

（1）α-淀粉酶单因素试验

1）选取酶解pH（5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0），酶解温度（55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃），酶解时间（2.0 h，2.5 h，3.0 h，3.5 h），加酶量（150 U/g，200 U/g，250 U/g，300 U/g，350 U/g）分别做单因素试验，以样品水解后的还原糖含量作为指标，选取单因素试验中淀粉水解程度较高的水平作为α-淀粉酶正交试验的水平。

2）DNS法检测还原糖含量：DNS试剂的配制：称取5.0 g DNS并溶于适量蒸馏水中，加入1 g苯酚，0.15 g亚硫酸钠，5.0 g NaOH，100 g酒石酸钾钠，搅拌至全部溶解，冷却，定容至1000 mL，摇匀，避光保存7天后使用。葡萄糖标准曲线的制作：准确称取100 mg葡萄糖对照品，定容于100 mL容量瓶中，置于4℃下保存。按表1进行溶液配制，振荡摇匀，沸水浴5min，冷却至室温，再加入蒸馏水5mL，摇匀，于550 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度、吸光度分别为横、纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。

表1葡萄糖标准溶液的配制

样品中还原糖含量的测定：样品用蒸馏水稀释8倍，准确吸取1.0 mL稀释后的样品溶液，准确加入DNS显色剂2.0 mL，同法显色，测定吸光度，重复3次平行试验。根据葡萄糖标准溶液的回归方程和公式1计算样品水解后的还原糖含量。

（2）α-淀粉酶正交试验：根据单因素试验确定因素水平，对酶解pH，酶解温度，酶解时间，加酶量进行四因素三水平L

表2α-淀粉酶的正交试验因素水平表

表3 α-淀粉酶的正交试验设计表

3、木瓜蛋白酶提取谷糠膳食纤维的正交试验

（1）木瓜蛋白酶单因素试验

1）选取酶解pH（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0），酶解温度（45℃，50℃，55℃，60℃，65℃），酶解时间（1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h），加酶量（50 U/g，100 U/g，150 U/g，200 U/g）分别做单因素试验。由于SDF比IDF更易被肠道菌发酵，具有更好的抗氧化特性和凝胶特性，以SDF得率/DF的蛋白质含量作为综合指标，选取单因素试验中综合指标较高的水平作为木瓜蛋白酶正交试验的水平。

2）蛋白质含量的测定：混合指示剂的配制：称取0.1 g甲基红，用无水乙醇定容至100 mL容量瓶中。称取0.1 g溴甲酚绿，同样用无水乙醇定容至100 mL容量瓶中。甲基红乙醇溶液和溴甲酚绿乙醇溶液按1：5比例混合，现用现配。10 mL混合指示剂与1000 mL 2%硼酸溶液混合，得到混合指示剂。

 40%氢氧化钠溶液：准确称取400g氢氧化钠，溶解于1000 mL蒸馏水中，冷却。盐酸标准溶液的配制：准确吸取9mL浓盐酸，加入适量蒸馏水混匀，再定容至1000 mL容量瓶中，摇匀，得到浓度为0.1 mol/L的盐酸标准滴定溶液。

DF的蛋白质含量的测定：将IDF与SDF混合均匀，得到DF。准确称取产物DF 0.300g于消化管中，加入3.00g硫酸钾，0.20g硫酸铜，10mL浓硫酸，置于消化炉中消解，冷却，放入全自动凯氏定氮仪中测定蛋白质含量。同法，不添加样品制备空白。DF的蛋白质含量计算公式如式2：

（2）木瓜蛋白酶正交试验：根据单因素试验确定因素水平，对酶解pH，酶解温度，酶解时间，加酶量进行四因素三水平L

表4木瓜蛋白酶的正交试验因素水平表

表5 木瓜蛋白酶的正交试验设计表

4、谷糠膳食纤维物化特性的测定：对谷糠DF进行持水力（Water HoldingCapacity，WHC）、膨胀力（Swelling Capacity，SC）的测定，并与米糠DF和麦麸DF的WHC、SC进行对比。

谷糠膳食纤维的持水力测定：SDF与IDF混合后得到DF，称取DF 1.000 g于50 mL离心管中，加入20 mL蒸馏水，混匀，放置于摇床上，37℃下以130 r/min振荡2 h，离心（3500r/min，10 min），吸去上清液，再离心（4000 r/min，20 min），小心吸去上清液，用滤纸吸干离心管壁上残留的液体，称其质量。WHC的计算公式如下：

谷糠膳食纤维的膨胀力测定：称取DF 1.000 g于10 mL刻度管中，加入10 mL蒸馏水，混匀，放置于37℃恒温水浴锅中，静置2 h，记录样品在刻度管中的体积变化。SC的计算公式如下：

二、数据处理：采用Student’s

三、实验结果

1、α-淀粉酶单因素试验结果：在酶解温度65℃，pH 6.5，酶解时间2.0 h的条件下，α-淀粉酶用量为150-350 U/g时，谷糠水解后的还原糖含量如图1中A所示。结果表明，加酶量为150-250 U/g时，谷糠水解后的还原糖含量逐渐升高，说明淀粉水解率也逐渐升高；而加酶量为250-350 U/g时，谷糠水解后的还原糖含量上升趋势不明显，几乎变化缓慢，说明淀粉水解程度变化不大。所以选取250 U/g，300 U/g，350 U/g作为α-淀粉酶正交试验的加酶量因素水平。

在加酶量250 U/g，酶解温度65℃，pH 6.5的条件下，酶解时间为2.0-3.5 h时，谷糠水解后的还原糖含量如图1中B所示。结果表明，随着酶解时间的增加，谷糠水解后的还原糖含量先升高后降低。酶解时间为2.5 h时，谷糠水解后的还原糖含量最高，说明淀粉水解程度也最大。所以选取2.0 h，2.5 h，3.0 h作为α-淀粉酶正交试验的酶解时间因素水平。在加酶量250 U/g，酶解温度65℃，酶解时间2.0 h的条件下，酶解pH为5.0-8.0 h时，谷糠水解后的还原糖含量如图1中C所示。结果表明，随着酶解pH的变化，谷糠水解后的还原糖含量处于波动状态。基于试验操作以及废水处理成本考虑，选取pH 6.5，7.0，7.5作为α-淀粉酶正交试验的酶解pH因素水平。在加酶量250 U/g，pH 6.5，酶解时间2.0 h的条件下，酶解温度为55-80℃时，谷糠水解后的还原糖含量如图1中D所示。结果表明，酶解温度为55-75℃时，谷糠水解后的还原糖含量逐渐升高，说明淀粉水解率也逐渐升高；而加酶量为75-80℃时，谷糠水解后的还原糖含量下降，说明淀粉水解程度降低。所以选取70℃，75℃，80℃作为α-淀粉酶正交试验的酶解温度因素水平。

2、α-淀粉酶正交试验结果：表6为α-淀粉酶正交试验结果与极差分析结果，表7为α-淀粉酶正交试验方差分析结果。表6中的极差分析显示，各影响因素对还原糖含量影响的主次顺序为B＞A＞C＞D，即影响淀粉水解程度的因素主次为酶解温度＞加酶量＞酶解pH＞酶解时间。表7中的方差分析显示，酶解温度，加酶量，酶解pH对淀粉水解程度有显著性影响，所以选择各因素下的最优水平A

表6 α-淀粉酶正交试验结果与极差分析

表7 α-淀粉酶正交试验方差分析结果

a. R

3、木瓜蛋白酶单因素试验结果：在酶解温度55℃，pH 7.0，酶解时间1.5 h的条件下，木瓜蛋白酶用量为50-200 U/g时，综合指标结果如图2中A所示。结果表明，加酶量为50-150 U/g时，综合指标逐渐升高；而加酶量为150-200 U/g时，综合指标变化趋于平缓。所以选取100 U/g，150 U/g，200 U/g作为木瓜蛋白酶正交试验的加酶量因素水平。在加酶量150U/g，酶解温度55℃，pH 7.0的条件下，酶解时间为1.0-2.5 h时，综合指标结果如图2中B所示。结果表明，酶解时间为1.0-1.5 h时，综合指标升高；而酶解时间为1.5-2.5 h时，综合指标大致呈下降趋势。所以选取1.5 h，2.0 h，2.5 h作为木瓜蛋白酶正交试验的酶解时间因素水平。在加酶量150 U/g，酶解温度55℃，酶解时间1.5 h的条件下，酶解pH为6.0-8.0 h时，综合指标结果如图2中C所示。结果表明，随着酶解pH的变化，综合指标处于波动状态。当酶解pH为7.5时，综合指标达到最大值。所以选取pH 6.5，7.0，7.5作为木瓜蛋白酶正交试验的酶解pH因素水平。在加酶量150 U/g，pH 7.0，酶解时间1.5 h的条件下，酶解温度为45-65℃时，综合指标结果如图2中D 所示。结果表明，酶解温度为45-50℃时，综合指标升高；而酶解温度为50-65℃时，综合指标下降。所以选取50℃，55℃，60℃作为木瓜蛋白酶正交试验的酶解温度因素水平。

4、木瓜蛋白酶正交试验结果：表8为木瓜蛋白酶正交试验结果与极差分析，表9为木瓜蛋白酶正交试验方差分析结果，表8中的极差分析显示，各影响因素对还原糖含量影响的主次顺序为C＞A＞B＞D，即影响综合指标的因素主次为酶解温度＞加酶量＞酶解pH＞酶解时间。表9中的方差分析显示，加酶量，酶解温度对综合指标有显著性影响，所以选择各因素下的最优水平A

表8木瓜蛋白酶正交试验结果与极差分析

表9木瓜蛋白酶正交试验方差分析结果

a. R

综上，α-淀粉酶和木瓜蛋白酶提取谷糠膳食纤维的最佳条件分别为α-淀粉酶（350U/g，70℃，pH 7.0，2.5 h），木瓜蛋白酶（100 U/g，60℃，pH 7.0，1.5 h）。此条件下SDF得率为22.67%，IDF得率为61.14%，总DF得率为83.81%。

5、谷糠膳食纤维的物化特性分析：由表10可知，谷糠DF的WHC、SC与常见的米糠DF和麦麸DF相比没有统计学意义上的差异，说明谷糠可以同米糠、麦麸一样用于代餐粉的复配开发。

表10谷糠、米糠和麦麸中DF的物化特性结果

谷糠主要含有DF、淀粉和蛋白质，因此提取DF前需先去除谷糠中的淀粉和蛋白质。采用正交试验确定α-淀粉酶和木瓜蛋白酶提取谷糠DF的最佳条件。SDF具有更好的降低胆固醇以及被肠道菌发酵的能力，而IDF具有更好的WHC和通便能力，有观点认为SDF应占总DF的30%-50%，才可以达到均衡摄入DF的要求。优化后的最佳提取工艺中谷糠SDF得率为22.67%，高现有技术中SDF得率。WHC与DF中的极性基团（如-OH，-COOH）、氢键和多孔结构有关，DF的吸水性和多孔结构也使DF具有SC。谷糠DF的WHC可以软化粪便，降低便秘的发病率；DF的SC可增加饱腹感，还能增加粪便体积，刺激肠壁，促进肠道蠕动，从而促进排便，减少有害物质在肠道的停留时间。

二、预防溃疡性结肠炎的膳食纤维代餐粉的研制及评价

1、膳食纤维代餐粉的配方设计：以脱脂谷糠超微粉为基料，复配黄豆粉、苦荞粉、玉米粉、苹果粉和甜蜜素。配料表如表11所示。

表11代餐粉配料表

2、谷糠膳食纤维代餐粉的感官评价：称取膳食纤维代餐粉10 g，加入30 mL 90℃的水，搅拌均匀，并由10个感官评价人员对代餐粉进行感官评价。代餐粉的感官评价标准如表12。

表12代餐粉的感官评价标准

3、谷糠膳食纤维代餐粉的理化检验

A、谷糠膳食纤维代餐粉水溶性指数（Water Solubility Index, WSI）、吸水性指数（Water Absorption Index, WAI）的测定：准确称取代餐粉2.00 g，加20 mL蒸馏水，90℃下磁力搅拌30 min，4000r/min离心20 min。记录沉淀的质量。上清液倒入蒸发皿中，放入烘箱，105℃下干燥6 h，冷却，称重。按公式（5），（6）计算谷糠膳食纤维代餐粉的WSI和WAI。

B、谷糠质量安全检测：农药残留限量：根据GB 23200对谷糠中多菌灵、吡虫啉、啶虫脒、有机磷类和氨基甲酸酯类农药进行含量测定。污染物限量：根据GB 5009.268-2016第一法检测谷糠中铅、镉、汞、砷和铬的含量。真菌毒素限量：根据GB 2761-2017检测谷糠中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的含量。

4、数据处理：采用Student’s

5、实验结果

A、膳食纤维代餐粉的感官评价、水溶性指数和吸水性指数结果

不同配比的膳食纤维代餐粉的感官评价、WSI和WAI结果见表13。1号代餐粉的感官评价和WSI高于其他组，而3号代餐粉的WAI显著高于其他组。所以综合考虑，选择1号代餐粉作为膳食纤维代餐粉的配方，即谷糠膳食纤维30%，黄豆粉25%，苦荞粉20%，玉米粉15%，甜蜜素0.06%和苹果粉9.94%。

表13代餐粉的感官评价、WSI和WAI结果

注：与1号代餐粉相比，*

B、谷糠质量安全检测结果：农药残留限量：谷糠中均未检出多菌灵、吡虫啉、啶虫脒、有机磷类（敌敌畏、乙酰甲胺磷、乐果、甲基对硫磷、毒死蜱、倍硫磷、三唑磷、甲拌磷、氧乐果、丙溴磷、甲胺磷、久效磷、对硫磷、杀扑磷、马拉硫磷和水胺硫磷）以及氨基甲酸酯类（涕灭威亚砜、克百威、灭多威、涕灭威、3-羟基克百威、甲萘威和异丙威）农药。污染物限量：谷糠中未检出重金属铅和铬。谷糠中含镉0.0914 mg/kg，汞0.0165 mg/kg，砷0.0173 mg/kg，均低于国标规定的重金属限量（镉0.1 mg/kg，汞0.02 mg/kg，砷0.5 mg/kg）。真菌毒素限量：谷糠中未检出玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和赭曲霉毒素。说明谷糠安全可食用，制备的谷糠膳食纤维代餐粉也符合食品安全要求。

三、谷糠膳食纤维及其代餐粉预防肠炎作用研究

1、实验动物：SPF级BALB/c雄性小鼠，体质量20 ±2 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2021-0006。小鼠在温度为25±2℃，相对湿度为45±15%的实验室条件下饲养，12 h光/暗周期，可自由饮水和摄食。小鼠适应性饲养7 d后进行实验，动物实验步骤均根据山西大学动物实验指南进行。

2、溶液配制：预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维DF混悬液：参考市面上的燕麦麸皮粉的折算出的成人每日DF服用量（0.135g/kg/d），折算其相当于小鼠的DF剂量为1.2 g/kg/d，所以DF组小鼠的给药剂量为1.2 g/kg/d。临用前用0.5%CMC-Na溶液悬浮溶解。

膳食纤维代餐粉混悬液：根据DF的给药剂量以及代餐粉中谷糠含73.81%的DF，折算代餐粉的给药剂量为4.8 g/kg/d。临用前用0.5% CMC-Na溶液悬浮溶解。纽崔莱纤维粉溶液：根据其推荐的成人每日服用量，折算出小鼠的给药剂量为0.09 g/kg/d。临用前用0.5%CMC-Na溶液悬浮溶解。0.5%（w/v）CMC-Na溶液：称取5.0 g CMC-Na于1000 mL蒸馏水，磁力搅拌并加热至溶解，冷却，放置一夜后使用。2%（w/v）DSS溶液：精密称定10gDSS溶解于500mL蒸馏水中，现配现用。活性炭悬液：称取5.0 g阿拉伯胶与40 mL蒸馏水混合，磁力搅拌并加热至溶解，再加入2.50 g活性炭混合均匀，冷却，蒸馏水定容至50 mL。5%D-木糖溶液：准确称取2.500 g D-木糖，加适量蒸馏水溶解，定容至50 mL容量瓶中。

3、动物实验方案：健康BALB/c雄性小鼠40只，随机分为空白组（C）16只，DF组（本发明所制备的预防溃疡性结肠炎的谷糠膳食纤维DF），谷糠膳食纤维代餐粉组（G）和纽崔莱纤维粉组（S）各8只。其中DF组小鼠给予DF混悬液（1.2 g/kg），G组小鼠给予本发明所制备的膳食纤维代餐粉混悬液（4.8g/kg），S组小鼠给予安利纽崔莱纤维粉溶液（0.09 g/kg），C组灌胃等量的0.5%CMC-Na溶液，持续灌胃29 d。灌胃第4周，C组中随机分出8只作为模型组（M），C组自由饮水8天，其余实验组自由饮用2%DSS5 d，再自由饮用2.5%DSS 3 d，直至小鼠普遍便血。其中G组与DF组折算后谷糠膳食纤维量相当。

4、小鼠一般状况观察及疾病活动指数（DAI）评分：实验期间注意观察小鼠的进食、皮毛、活动以及精神情况。造模期间，测量并记录小鼠摄食量、摄水量和体重，并观察粪便性状和便血情况。小鼠便血情况用尿粪隐血测试盒进行评估。DAI评分标准如表14。

表14疾病活动指数评分标准

5、样本采集及处理：实验第29 d收集各组小鼠粪便。解杀小鼠1 h前，给予小鼠5%D-木糖溶液灌胃（10 mL/kg）。小鼠摘眼球取血，静置30 min，离心（13 000 r/min，15min），取上层血清。小鼠脱颈椎处死，摘取肾脏，肝脏和脾脏，称其质量，计算脏器指数（mg/g）。分离小鼠的结肠，收集结肠内容物，测量其长度和质量，计算其结肠指数（mg/g），单位结肠质量（结肠质量/结肠长度（mg/mm））。采集的动物样本放置于-80℃冰箱备用。分离得到的血清，按照试剂盒说明书测定TNF-α，IL-10和D-木糖的含量，采用Curve Expert 1.4软件绘制标准曲线。

结肠用4%多聚甲醛固定（＞48 h），委托赛维尔生物科技有限公司进行结肠组织病理切片的制作，包括脱水，石蜡包埋，切片，染色和封片；并进行Occludin蛋白和P物质的免疫组化，包括脱蜡，修复抗原，内源性过氧化物酶的阻断，封闭血清，一抗，二抗的加入，复染和封片。采用Image J软件对免疫组化结果进行半定量分析。

6、结肠组织病理评分：结肠经HE染色后，根据表15进行组织病理评分。

表15结肠组织病理评分标准

7、数据处理：采用GraphPad Prism 9.0软件作图，两组之间比较采用独立样本

8、粪便极性部位代谢组学：粪便的预处理及进样条件参考（Yu S, Fan J, ZhangL, et al. Assessment of Biphasic Extraction Methods of Mouse FecalMetabolites for Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based MetabolomicStudies[J]. J Proteome Res, 2021, 20(9):4487-4494.）的方法。

9、粪便样本极性部位提取：粪便样本冷冻干燥后，用研钵研磨为粉末。提取溶剂提前在4℃冰箱中预冷。准确称取15 mg粪便样本，加入243.3 μL 80%甲醇水溶液，涡旋混匀，再加入843.74 μL甲基叔丁基醚，涡旋混匀，超声20 min。最后加入421.95 μL超纯水，并放置于4℃冰箱中静置30 min至两相分离，离心（5000 r/min，15 min），取下层极性部位于EP管中，用真空浓缩仪干燥。

进样前用150 μL 80%甲醇水溶液复溶，离心（12 000 r/min，10 min），吸取上清液进行液相质谱分析。每个样品各取5 μL混合得到质控（QC）样本，以检测仪器的稳定性。

10、UHPLC Q-TOF MS分析：色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITYUPLC HSS T3（2.1mm×100 mm，1.7 µm)，柱温为40℃，流速0.3 mL/min，进样量为5 µL。流动相洗脱条件如表16。

表16液相洗脱梯度

质谱条件：质谱离子源为电喷雾电离（ESI）离子源，正负离子模式分别扫描。离子源温度为550℃，离子化电压为正离子模式下+5500 V，负离子模式下-4500 V，雾化气压力（GS1）和辅助气压力（GS2）为55 psi，气帘气（CUR）为30 psi，去簇电压（DP）为60 V。采用TOFMS-IDA-MS/MS扫描模式采集数据。一级质谱扫描范围为

11、数据处理及分析：采用ABF Converter软件将UHPLC-Q-TOF/MS采集获得的原始数据文件（.wiff）转化为.abf格式文件。将.abf格式文件导入MS-Dial软件进行峰提取、峰对齐、归一化，得到数据矩阵。在悟空云平台（https://omicsolution.org/wkomics/main/）用K近邻法对数据进行缺失值填充。之后采用相对保留偏差（RSD）对QC中的数据进行评价，剔除RSD＞30%的数据，保留RSD＜30%的数据进行多元统计分析。多元统计分析在SIMCA-P13.0 软件上进行，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）分析和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分析。采用Student’s

四、微生物组学

1、结肠内容物16S rRNA基因测序：结肠内容物的16S rRNA基因测序委托派森诺生物科技股份有限公司完成。首先提取结肠内容物中的肠道菌的DNA，并进行PCR扩增，对PCR产物进行定量和鉴定。最后生成测序库，进行MiSeq高通量测序。

2、数据处理：微生物数据处理在派森诺基因云平台（https://www.genescloud.cn/login）上进行。采用α多样性评价物种多样性的复杂性，采用β多样性评价物种复杂性方面的差异，采用物种组成分析对微生物组在门水平和属水平上的相对丰度进行分析；采用LEfSe分析筛选差异菌群。

3、微生物组学与粪便代谢组学相关分析：在悟空云平台（https://www.omicsolution.org/wkomics/main/）上对差异菌群和粪便差异代谢物进行spearman相关分析，以

五、实验结果

1、高膳食纤维饮食对DSS诱导的UC小鼠的预防作用结果

A、小鼠一般状况观察及疾病活动指数评分：造模期间，C组小鼠毛色光亮，行为活跃，粪便性状正常，其余组分别有不同程度的摄食量减少，皮毛杂乱，粪便变软甚至不成形。如表17所示，与C组相比，M组小鼠的摄食量显著减少，说明DSS造模使小鼠食欲不振；与M组相比，各高DF饮食预防组的摄食量没有显著性差异，其中G组小鼠摄食量较低，可能是G组的给药剂量相对较大，小鼠的饱腹感相对较强。造模期间，M组与各高DF饮食预防组的摄水量没有显著性差异，说明M组和各高DF饮食预防组摄入的DSS溶液体积没有显著性差异，提示各组间造模程度差异可能较小。图3显示，与C组相比，M组的DAI评分显著升高，说明造模成功；与M组相比，各高DF饮食预防组的DAI评分均下降，其中DF组和S组显著减轻了DSS引起的粪便性状异常和便血情况。

表17造模期间各组小鼠的摄食量，摄水量（

注：与C组相比，

B、小鼠的结肠状态及脏器指数：

如图4和表18所示，与C组相比，M组小鼠结肠长度显著缩短，说明造模成功。与M组相比，各高DF饮食预防组小鼠结肠长度增加，其中DF组和S组显著增加。与C组相比，M组小鼠单位结肠质量和结肠指数均显著增加；相比M组，各高DF饮食预防组均有不同程度的显著回调，其中G组虽对结肠长度没有显著回调，但对单位结肠质量有明显回调。以上说明高DF饮食一定程度上减轻了DSS引起的结肠状态异常。同样地，与C组相比，M组小鼠脾脏和肾脏指数显著增加；与M组相比，虽各高DF饮食预防组均有回调，但仅有S组有显著性差异。上述结果说明，DF、G和S不同程度地减轻了DSS引起脾脏和肾脏状态异常，其中S显著回调的指标最多，DF次之，G最少。

表18造模期间各组小鼠结肠长度，单位结肠质量，脏器指数（

注：与C组相比，

C、结肠组织病理评分：如图5所示，C组小鼠结肠形态正常，上皮细胞之间有杯状细胞分布，隐窝形态结构正常，未发现炎症改变，而M组小鼠结肠组织黏膜层可见较多上皮细胞坏死脱落，局部可见少量肠腺坏死溶解，被增生的结缔组织取代，伴有点状的淋巴细胞浸润。与C组相比，M组结肠组织病理评分显著增加；与M组相比，各高DF饮食预防组的结肠组织病理评分降低，上皮细胞脱落和肠腺坏死减少，炎症减轻。

D、血清中炎症因子水平：采用TNF-α评价小鼠体内促炎因子的水平，采用IL-10评价小鼠体内抗炎因子的水平。如表19所示，DSS造模显著增加了小鼠血清中的TNF-α水平，降低了IL-10水平；而各高DF饮食预防组不同程度地减轻DSS引起的免疫紊乱，其中DF具有显著差异。

表19血清中TNF-α和IL-10含量（

注：与C组相比，

E、膳食预防对肠道分泌P物质的影响：P物质是一种神经肽类物质，主要表达于结肠固有膜血管壁和黏膜下神经丛。如图6所示，与C组相比，M组中P物质的表达增加；与M组相比，各高DF饮食预防组小鼠结肠中P物质的表达有所下降，说明高DF饮食一定程度上减轻了DSS引起的P物质分泌异常。

F、膳食预防对肠道屏障功能的影响：

采用血清中的D-木糖含量以及结肠中的Occludin的表达评价UC小鼠的肠道屏障功能。

（1）血清中D-木糖含量：如表20所示，与C组相比，M组血清中木糖含量上升，说明DSS造模后肠道通透性增加，肠道屏障受损，而各高DF饮食预防组的肠道屏障受损程度均较轻，说明高DF饮食一定程度上可以保护肠道屏障。

表5.9 血清中木糖含量（

（2）结肠中Occludin的表达：如图7所示，C组小鼠结肠中紧密连接蛋白Occludin表达于腺体细胞中及隐窝上皮细胞边缘，且连续分布形成封闭屏障，而M组中Occludin分布间断，说明DSS造模破坏了肠道屏障。相比M组，各高DF饮食预防组中Occludin表达有所上升，说明高DF饮食一定程度上预防了DSS对小鼠的肠道黏膜屏障的损伤并恢复肠道屏障功能。但G组回调较为轻微，Occludin形成的肠道屏障相较DF组和S组较薄。

G、粪便极性部位代谢组学结果

（1）粪便代谢组学QC评价：为了检测仪器在进样期间的稳定性，以QC样本进行质量评价。如图8所示，所有QC样本都在2倍标准偏差的范围之内，说明仪器稳定，适合大批量进样，获得的数据可靠性较好。

（2）代谢轮廓分析：正、负离子模式下的PCA散点图显示，C组与M组之间有分离趋势。进一步的PLS-DA散点图显示，C组与M组明显分离，说明DSS造模明显改变了小鼠的代谢谱，各高DF饮食预防组分散在C组与M组之间，说明高DF饮食对M组小鼠的代谢紊乱具有改善作用。PLS-DA的排列试验显示，所有的排列值均小于原始值，表明模型稳定可靠。

（3）差异代谢物的筛选与鉴定：为筛选C组与M组间的差异代谢物，基于了OPLS-DA的S-plot进行可视化分析（图10）。最终鉴定得到44个差异代谢物，包括牛磺酸、色氨酸、酪氨酸和脱氧胆酸等。其中26个差异代谢物显著上调，18个差异代谢物显著下调。DF组回调了34个差异代谢物，G组回调了41个差异代谢物，S组回调了39个差异代谢物。

（4）α多样性分析：α多样性可以表征物种在生境内的多样性。稀疏曲线（图11中A）显示，随着抽平深度的增加，样本曲线趋于平缓，说明测序量充足。物种累计曲线（图11中B）显示，物种丰富度不再随样本量的扩大而显著增加，说明样本量足够反映群落的物种组成。如图11中C所示，与C组相比，M组覆盖度显著升高，丰富度和多样性显著降低，而各高DF饮食预防组均有不同程度的回调，说明高DF饮食一定程度上缓解了DSS导致的肠道菌异常。

（5）β多样性分析：β多样性可以表征样本间的差异。采用基于weighted-UniFrac的PCoA分析β多样性。如图12所示，C组与M组明显分开，且C组分布更广，说明DSS造模使小鼠结肠的物种组成产生了明显的差异，并降低了M组的肠道菌群多样性，而各高DF饮食预防组对M组小鼠的肠道微生物紊乱有回调作用。

（6）物种组成分析：基于门水平的物种组成分析：采用物种组成分析对结肠微生物组在门水平上的相对丰度进行分析。基于门水平的物种组成分析如图13所示，

基于属水平的物种组成分析：采用物种组成分析对结肠微生物组在属水平上的相对丰度进行分析。基于属水平的物种组成分析如图13所示，

LEfSe分析：为了进一步寻找C组与M组间的特征性差异，采用LEfSe分析筛选差异菌群。如图15所示，柱子越长表示该肠道菌在两组间的差异越显著，条形颜色表示该肠道菌所在丰度最高组。C组与M组共筛选出14个显著性差异物种，其中

微生物组学与粪便代谢组学相关分析：为进一步研究肠道微生物和粪便代谢物的关系，将14个差异菌群和44个粪便差异代谢物进行spearman相关分析。如图16所示，共有33个差异代谢物与12个（＞85%）差异菌群显著相关（

各高DF饮食预防组均不同程度地降低了DAI评分，并缓解了结肠长度的缩短以及单位结肠质量的增加，说明高DF饮食能够减轻UC小鼠的软便、便血和宏观上的结肠形态异常。各高DF饮食预防组均不同程度地降低了结肠组织病理评分，说明高DF饮食能够缓解UC小鼠的结肠组织结构异常。实验结果表明，各高DF饮食预防组能不同程度地回调DSS导致的肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数升高，说明高DF饮食能够一定程度减轻UC小鼠的伴发疾病症状。

结果显示，高DF饮食预防组可以回调过度表达的TNF-α水平，并促进抗炎因子IL-10的表达，从而调节免疫失衡。这说明高DF饮食有助于通过调节免疫失衡来减轻UC小鼠的炎症，进而改善减轻UC小鼠中的脏器指数异常。相较于结肠病理、脏器指数等宏观指标，各高DF饮食预防组对UC小鼠血清中炎症因子的调节并不显著，这可能是饮食干预对炎症因子的调节作用有限。各高DF饮食预防组可以降低UC小鼠结肠上P物质的表达，从而减轻炎症，缓解肠道运动异常导致的腹部痉挛和排便频率增加。各高DF饮食预防组可以降低血清中D-木糖含量，升高结肠中的Occludin表达水平，表明高DF饮食一定程度上可抵抗DSS对小鼠结肠屏障的破坏。

综上所述，相较C组，M组

各高DF饮食预防组中酪氨酸、色氨酸的含量均降低，提示高DF饮食可能通过回调酪氨酸、色氨酸代谢水平以缓解肠道屏障受损，进而改善DSS引起的肠道通透性增加。

高DF饮食不仅减轻了DSS导致的UC症状，还缓解了UC小鼠的粪便代谢物水平和肠道菌群紊乱。粪便代谢组学与微生物组学spearman分析得到显著相关的33个差异代谢物与12个差异菌群中，G组回调的差异代谢物和差异菌群数目最多，S次之，DF最少。在系统调节代谢物和肠道微生物的方面，G相较DF与S对机体具有更广泛的调节作用，其预防UC作用优于DF和S。这可能是因为G成分更为丰富，除含DF以外，其含有的多酚等活性成分也对粪便代谢物及肠道菌群起积极调节作用。S的成分为SDF，相较DF更易被肠道菌群发酵，能为肠道菌提供更多的能量并发挥免疫调节作用。而且菊粉是公认的益生元，能够促进有益菌的繁殖并减轻炎症反应，可用于轻、中度UC的辅助治疗。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。