一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量测序中的应用

摘要

本发明公开了一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1、检测受试者样品中细胞表面脆弱微生物，步骤S2、样本制备，步骤S3、微生物DNA进行文库构建并进行测序，步骤S4、数据分析和出具报告。本发明还公开了所述细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法在高通量测序中的应用。本发明公开的细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法可以选择性地保护脆弱微生物的完整性，大大提高了样本中该类微生物的检测阳性率，完善了高通量测序方法检测病原微生物的种类和范围，提升了通过此类技术手段辅助诊断的意义；检测结果检测效率高，适用于临床样本中脆弱微生物检测及该类微生物群落研究等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种基于高通量测序的临床样本中细胞表面脆弱(细胞壁薄/不稳定/无细胞壁等)微生物核酸富集的方法及其应用。

背景技术

近年来，随着二代测序技术的应用，宏基因组病原体测序使高通量、精准的遗传学研究在诊断领域成为可能。但临床样本中，病原体相较宿主细胞含量极微，极大程度降低了病原体检测灵敏度，因此病原体的富集对临床样本中微生物的检测有重大作用。

目前病原体在提取过程中的富集主要分为提取前富集(Pre-Extraction)和提取后富集(Post-Extraction)两种形式。提取前富集主要发生在细胞层面，通过细胞水平的差异完成宿主与微生物细胞分离，去除宿主核酸后获得微生物细胞，并通过核酸提取步骤富集微生物核酸；提取后富集主要发生在核酸层面，细胞破碎后通过探针法靶向性捕获微生物核酸，或者通过宿主与微生物核酸甲基化差异，完成富集。

在提取后富集的方式中，通过探针法进行提取后富集靶向性范围小而应用受到限制；甲基化差异很难区分宿主与真核微生物核酸(及部分原核生物核酸)。提取前富集中，需考虑临床微生物常见病原体细胞壁表面结构差异较大，存在刚性较强的革兰氏阳性细菌(表面肽聚糖层多)及真菌，同时存在细胞壁薄/不稳定的微生物(如支原体、衣原体及部分革兰氏阴性细菌等)，后者极易受到宿主细胞破碎时的干扰而被去除，从而导致本类病原体在测序结果中的遗漏，贻误病情判断。

基于上述背景，本发明旨在提供一种基于宏基因组学高通量微生物测序技术中针对细胞表面脆弱微生物的富集方式。

本发明基于高通量测序技术构建了区分宿主细胞与细胞表面脆弱微生物(如支原体、衣原体等)的裂解液配比组合。本发明可区分宿主细胞与该类病原体细胞表面(如支原体、衣原体等)。基于本发明的检测方法，可有效提升高通量测序中这类病原体的检测灵敏度，提升相关病原体相关高通量测序的检出率。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量测序中的应用，该方法通过研制新型裂解液配方，在裂解宿主细胞的同时，可以选择性地保护脆弱微生物的完整性，大大提高了样本中该类微生物的检测阳性率，完善了高通量测序方法检测病原微生物的种类和范围，提升了通过此类技术手段辅助诊断的意义；检测结果检测效率高，适用于临床样本中脆弱微生物检测及该类微生物群落研究等领域。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1、检测受试者样品中细胞表面脆弱微生物：采用检测受试者样品中细胞表面脆弱微生物的高通量测序检测方法测受试者样品中细胞表面脆弱微生物；

步骤S2、样本制备：选取核酸提取样本，然后依次进行采用裂解试剂对临床样本中宿主细胞裂解、宿主核酸去除、细胞表面脆弱微生物裂解及核酸提取；其中宿主核酸去除试剂成分为TURBO

步骤S3、微生物DNA进行文库构建并进行测序；

步骤S4、数据分析和出具报告。

进一步地，步骤S1中所述检测受试者样品中细胞表面脆弱微生物的高通量测序检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤C1：提取受试者样品中细胞表面脆弱微生物的DNA；

步骤C2：将步骤S1所得微生物DNA进行文库构建并进行测序；

步骤C3：对步骤S2的测序数据进行数据库中的生物信息学分析，判断是否有微生物序列存在，从而判断患者是否感染该种微生物。

进一步地，步骤S2中所述核酸提取样本类型，包括外周血、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液中的至少一种。

进一步地，步骤S2中所述裂解试剂成分为：0.5％～2％β-辛基硫代葡萄糖苷+0.5％～2％β-十二烷基麦芽糖苷，优选1％β-辛基硫代葡萄糖苷+1％β-十二烷基麦芽糖苷。

进一步地，步骤S3中所述微生物DNA进行文库构建并进行测序，具体为：将制备好的核酸进行文库构建；文库构建包括核酸片段化、加接头、文库扩增等流程；文库构建可通过Illumina平台、Iontorrent平台或其它具有相同/似功能的高通量测序平台均可；再照Illumina平台、Iontorrent平台或其它具有相同/似功能的高通量测序平台的说明书进行操作上机测序。

进一步地，步骤S4中所述数据分析和出具报告包括测序数据质量的评估、去除宿主序列、与微生物数据库进行比对、阳性微生物物种判读和出具报告。

本发明的另一个目的在于提供一种所述细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法在高通量测序中的应用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

(1)本发明的一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量测序中的应用，检测对象为临床样本中的细胞表面脆弱微生物，包括无坚固细胞壁支撑的支原体、衣原体、部分革兰氏阴性菌、部分寄生虫等，克服了常规临床样本中微生物的富集方式，通常是通过宿主细胞与微生物细胞差异裂解完成，在宿主细胞裂解过程中，部分细胞壁脆弱的微生物细胞破裂，核酸随宿主核酸一起被核酸酶消化，从而干扰了此类病原微生物的检测的缺陷，检测效果好，检测效率高，检测灵敏度佳。

(2)本发明的一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量测序中的应用，构建了区分宿主细胞与细胞表面脆弱微生物(如支原体、衣原体等)的裂解液配比组合，通过研制新型裂解液配方，在裂解宿主细胞的同时，可以选择性地保护脆弱微生物的完整性，大大提高了样本中该类微生物的检测阳性率，完善了高通量测序方法检测病原微生物的种类和范围，提升了通过此类技术手段辅助诊断的意义。

(3)本发明的一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量测序中的应用，检测结果检测效率高，适用于临床样本中脆弱微生物检测及该类微生物群落研究等领域。

(4)本发明的一种细胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量测序中的应用，该方法可区分宿主细胞与该类病原体细胞表面(如支原体、衣原体等)。基于本发明的检测方法，可有效提升高通量测序中这类病原体的检测灵敏度，提升相关病原体高通量测序的检出率。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；除非特别指明，本文所用术语具有所属技术领域一般技术人员理解的通常含义。以下列出了本文所用一些术语的解释，除非特别指明，这些术语的解释以本文定义为准。

术语“细胞表面脆弱微生物”，指微生物中细胞壁薄/不稳定的一类，包括支原体、衣原体、部分革兰氏阴性菌、部分寄生虫等。

本发明中，所述临床样品可为任何临床样本类型，如外周血、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液等。其中采集样本为粘稠物质时，如痰液的处理流程为，样本加入1-3倍体积的液化剂进行液化15～30min，然后12000rpm离心5min，收集沉淀，并用1mL生理盐水洗涤沉淀2次，收集沉淀进行核酸提取。采集样本为非粘稠物质时，如外周血、脑脊液等，直接8000rpm离心5min，收集沉淀进行核酸提取。

本发明中，样本中宿主核酸去除后微生物的提取采用QIAamp UCP Pathogen MiniKit或其它有相同/似功能的试剂盒完成。

本发明中，样本文库构建试剂盒针对不同高通量测序平台可采用相应建库试剂盒完成，本文实施例中提供方法为KAPALibrary Preparation Kits(Illumina平台)。

本发明中，可以通过本领域已知的任何高通量测序技术进行测序(需配备相应平台的文库构建及上机测序试剂盒等)，本发明的实施例提供方法为例如Illumina测序平台(Nextseq550等)。

由于临床样本中微生物提取中，常规差异裂解导致脆弱微生物大量裂解且核酸被消化，严重制约了该类微生物的检出率。本发明提供一种新型核酸富集方式，通过新型裂解液选择性裂解宿主细胞，避免细胞壁脆弱的微生物随宿主裂解，提高其检测灵敏度。

在本发明的方法中流程如下：样本核酸提取(包括宿主细胞裂解、宿主核酸去除、微生物细胞裂解、微生物核酸富集等)；构建文库(采用本领域已知的方法进行，流程包括，末端修复、加接头、进行PCR文库富集等)；通过Qubit和Agilent2100对文库质量和浓度进行检测和鉴定；上机测序并完成数据分析。

实施例1

不同裂解组分裂解效果

一、样本类型及测试微生物

1.样本：成人新鲜外周血

2.测试微生物：

a)革兰氏阴性细菌：铜绿假单胞菌(CGMCC 1.15148)、大肠埃希氏菌(CGMCC1.12883)；

b)支原体：肺炎支原体(ATCC 15531-TTR)；

c)衣原体：肺炎衣原体(ATCC 53592)。

二、对比方法

取五管平行3mL样本(新鲜外周血掺入测试微生物后分管)，编号为1-A，1-B，1-C，1-D与1-E，通过提取中使用不同细胞裂解液组分，进行对比。

表1细胞裂解液配方

三、实验流程

核酸提取

(1)8000rpm离心5min，弃上清；

(2)向沉淀中加入550μLPBS重悬；

(3)按表1加入不同裂解组分；

(4)室温孵育10min；

(5)12000rpm离心5min，弃上清(剩余体积约50μL)；

(6)沉淀加入5μL 10×buffer，2μL Turbo Dnase；

(7)37℃孵育15min；

(8)12000rpm离心5min，弃上清；

(9)200μLPBS悬浮沉淀；

(10)12000rpm离心5min，收集沉淀。

以下步骤通过QIAamp UCPPathogen Mini Kit完成。

(11)向以上离心管补加500μL的BufferATL(包含DX)，重悬沉淀；

(12)将离心管以最大速度旋涡10min；

(13)将离心管8000x g离心5s，以去除管内的水滴

(14)小心转移400μl上层清液进入一个新鲜的2ml新的离心管

(15)继续补加40μl蛋白酶K并旋涡混匀10s，瞬时离心3s

(16)56℃孵育10min

(17)继续在离心管中加入200μl的缓冲液APL2。盖上盖子涡旋混匀30s，并瞬时离心3s。

(18)70℃孵育10min；

(19)瞬时离心，保证管盖无残留液体

(20)继续向离心管中加入300μl乙醇，盖上盖子涡旋混匀15-30s，瞬时离心3s。

(21)小心取混匀后的混合液体置于2mL收集管中，8000rpm离心1min,将吸附柱置于干净的2ml收集管中，丢弃含有滤液的试管

(22)将步骤(20)混合剩余的液体按步骤(21)重复操作

(23)小心打开吸附柱的盖子并补加600μl的BufferAPW1，关闭盖子8000rpm离心1min，将吸附柱置于干净的2ml收集管中，丢弃含有滤液的试管

(24)小心打开吸附柱的盖子并补加750μl的BufferAPW2，关闭盖子。14,000rpm离心3min

(25)推荐，吸附柱转移到新的2ml的收集管中丢弃含有滤液的试管，14,000rpm离心1min

(26)放置吸附柱于新的2ml的收集管丢弃含有滤液的试管，打开盖子并56℃孵育3min，保证柱膜完全干燥

(27)放置吸附柱于新的1.5ml洗脱管中丢弃含有滤液的试管，小心加入20–100μl的BufferAVE于柱膜上，盖上盖子室温放置1min

(28)14,000rpm离心1min，收集核酸。

文库构建

所用试剂盒为KAPALibrary Preparation Kits。文库构建流程包括末端修复、末端加A、加接头、文库扩增四步。

2.1末端修复

(1)取富集提取的游离核酸DNA 50μL，加入8μL无核酸酶水，7μL末端修复缓冲液，5μL末端修复酶，混合均匀；

(2)将反应管置于PCR仪，按下述程序进行反应：20℃，30min；

(3)向反应结束的反应管中加入120μL(1.7×)KAPA纯化磁珠，旋涡混匀，室温放置5min；

(4)将反应管置于磁力板上，静置3min，至溶液澄清，移除上清；

(5)向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；

(6)重复步骤5一次；室温干燥3-5min，将管从磁力板上取下；

2.2末端加A

(1)配制末端加A混合液：取一200μLPCR管，按顺序加入42μL无核酸酶水、5μL末端加A缓冲液、3μL末端加A酶，混合均匀，瞬时离心；

(2)将配制好的上述反应液加入到第一步中，经室温干燥含有磁珠的管中，旋涡混匀；

(3)将反应管置于PCR仪，运行下述程序：30℃，30min；

(4)反应结束后，向反应液中加入90μL PEG/NaCl溶液，旋涡混匀，室温孵育10-15min；

(5)将反应管置于磁力板上，静置3min，至溶液澄清，移除上清；

(6)向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；

(7)重复步骤6一次；室温干燥3-5min，将管从磁力板上取下；

加接头

(1)配制接头连接混合液：取一200μLPCR管，按顺序加入30μL无核酸酶水、10μL连接缓冲液、5μLDNA连接酶，旋涡混匀

(2)将上述配制的接头连接混合液加入到第二步干燥的磁珠中，加入5μL相应的接头储存液；

(3)将反应管置于PCR仪汇总，按下述程序进行反应，20℃，15min；

(4)反应结束后，向反应液中加入50μL PEG/NaCl溶液，旋涡混匀，室温孵育10-15min；

(5)将反应管置于磁力板上，静置3min，至溶液澄清，移除上清；

(6)向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；

(7)重复步骤6一次；

(8)室温干燥3-5min，将管从磁力板上取下；

(9)用50μL洗脱缓冲液重悬磁珠，室温孵育2min

(10)向上述磁珠溶液汇中加入50μL的PEG/NaCl溶液

(11)旋涡混匀，室温孵育5-15min，

(12)瞬时离心，将管置于磁力架上，静置2min至溶液澄清，移除上清；

(13)向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；

(14)重复步骤13一次

(15)将管置于磁力架上，室温干燥3-5min，向管汇总啊计入25μL洗脱缓冲液，重悬磁珠，室温孵育2min；

(16)将管置于磁力架上，静置2min，至溶液澄清，转移20μL上清液于一新的200μL管中，备用

2.4文库扩增

(1)向上述步骤三制得的20μL核酸溶液中加入25μL扩增缓冲液、5μL引物混合液，混合均匀；

(2)将反应管置于PCR仪中，按下述程序进行反应98℃，45s，1个循环；98℃，15s→60℃，30s→72℃，1min，8-10个循环；72℃，1min，1个循环，4℃，hold

(3)反应结束后，向反应管中加入50μL(1×)KAPA纯化磁珠，旋涡混匀，室温放置5min；

(4)将反应管置于磁力板上，静置3min，至溶液澄清，移除上清；

(5)向管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30s，移除上清；

(6)重复步骤5)一次；

(7)室温干燥3-5min，将管从磁力板上取下；

(8)加入30μL洗脱缓冲液，混匀，室温孵育2min；

(9)将管置于磁力架上，静置2min至溶液变澄清，将上清转至200μL PCR管中，进行Qubit定量和Agilent2100文库质量鉴定。

3.上机测序

可采用Nextseq550等Illumina平台仪器，按照商品化说明书进行测序。

4.数据分析和出具报告

四、实验结果

上机测序结果统计，如表2所示，五种方法对宿主细胞裂解效果无显著差异。

但如表3所示，比较支原体、衣原体及两种革兰氏阴性菌特异性reads数，D/E两种裂解方法(即β-辛基硫代葡萄糖苷和β-十二烷基麦芽糖苷作为裂解液)的方法中四种微生物检测特异reads数占比最多，方法A/B/C效果较弱且无显著差异。其中支原体类，通过D方法提升效果最显著(提升效果为5～10倍左右)；衣原体类，通过E方法提升效果最为显著(提升效果为10倍左右)；革兰氏阴性菌(大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌)特异性reads数，D/E方法类似，均有50％左右提升。

推测原因为支原体、衣原体类细胞表面存在差异，适应于不同类型的裂解液；而革兰氏阴性菌存在2～3层肽聚糖组成的细胞壁，对微生物细胞存在较支原体、衣原体类更强的保护效果。

表2不同裂解方法宿主裂解效果对比

表3不同裂解方法微生物富集效果对比

实施例2

裂解组分不同配比的测试

一、样本类型及测试微生物

1.样本：成人新鲜外周血

2.测试微生物：

a)革兰氏阴性细菌：铜绿假单胞菌(CGMCC 1.15148)、大肠埃希氏菌(CGMCC1.12883)；

b)支原体：肺炎支原体(ATCC 15531-TTR)；

c)衣原体：肺炎衣原体(ATCC 53592)；

二、对比方法

取12管平行3mL样本(新鲜外周血掺入测试微生物后分管)，按表4进行编号，通过提取中β-辛基硫代葡萄糖苷及β-十二烷基麦芽糖苷不同浓度，进行对比。

三、实验流程

按实施例1的方法对四管外周血进行核酸提取-文库构建-上机测序-数据分析流程，其中不同浓度配比如下。

表4细胞裂解液配方

四、实验结果

检测结果如下表5和表6所示。

如表5所示，随着两种裂解液浓度提升，宿主细胞裂解效果增强，但提高至2％以上，宿主细胞剔除无明显增强。

如表6所示，两种裂解液，随着浓度的提高，微生物特异性reads数检出均呈先提升后下降趋势，并于裂解液总浓度2％为峰值。分析其原因，裂解液浓度低时，宿主剔除效果差，相近总reads数中测得的微生物相对reads数量少；随着裂解液浓度提高至对宿主细胞裂解能力较强但对细胞外壁不稳定的微生物裂解力较弱时，达到微生物检测峰值；随着裂解液浓度进一步提高，大量微生物随着宿主细胞同步裂解并被核酸酶消化，因此检测量下降。因此确定宿主裂解过程中，总浓度为2％为最优。

分析微生物特异性reads数及占比，发现两种裂解液以1％+1％混合后，对代表性的支原体类、衣原体类、革兰氏阴性菌类菌检测效果较好。

实施例3

在实际临床样本中的应用

一、样本类型：成人新鲜外周血3例、肺泡灌洗液3例、脑脊液3例、痰液3例。均为临床样本，院方检测结果如表7所示。

二.实验流程

1.核酸提取

1.1发明方法：通过实施例1的方法完成核酸提取，其中宿主细胞裂解液为1％β-辛基硫代葡萄糖苷+1％β-十二烷基麦芽糖苷。

1.2对比方法：采用相似方法进行差异裂解的商品化试剂盒QIAamp DNAMicrobiome Kit、MolYsis Kit及Pureprove Kit进行对比实验。

2.文库构建：采用实施例1中的方法完成文库构建。

3.上机测序及数据分析：采用实施例1中的方法完成上机测序及数据分析。

三.实验结果

如表7所示，相较常规几个商品化试剂盒，本发明方法对支原体、衣原体及部分革兰氏阴性菌的富集效果均有明显提升(10～50倍)，而对革兰氏阳性菌检测效果相当。推测常规商品化试剂盒宿主细胞裂解液作用较强，导致部分细胞壁结构脆弱的微生物在此步骤裂解并随之被消化，导致检出效率降低；但细胞壁较坚硬的革兰氏阳性菌可耐受，因此检出效率无显著差别。

结果表明，本发明方法可有效提升多种临床样本中细胞壁脆弱微生物的检出效率。

表5不同裂解液宿主裂解效果对比

表6不同裂解液微生物富集效果对比

表7不同方法对微生物富集结果对比

以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。