高通量核酸测序技术及其在原始现生物种microRNA表达分析中的应用

摘要

MicroRNA通过与mRNAs中的3'端非编码区域(untranslated region，UTR)作用，引起靶基因的降解或抑制其翻译，最终达到抑制特定基因表达的目的。3'UTR的演化可能与其microRNA的结合位点的减少或者增加有关，从而microRNA可以通过对其靶标的影响在生物演化中起到关键性作用。因此可将microRNA看做是一种研究物种演化发育的标签分子。本论文通过对文昌鱼和舌形贝microRNA的测序，分析了microRNA在原始现生物种中的表达差异，为相关动物类群演化起源的研究提供了基础。
　　文昌鱼（Branchiostoma lanceolatum）属于头索动物亚门（Cephalochordata）。比较基因组学研究表明，头索动物亚门是现存脊索动物门（Chordata）中最为原始的亚门。文昌鱼做为头索动物亚门现存的唯一代表，对研究脊索动物早期的演化起源具有重要的生物学意义。本论文中，我们提取成体文昌鱼的总RNA，然后以标准方法特异性提取其中的总MicroRNA，运用东南大学自主研发的AG-100高通量测序平台检测成体文昌鱼的microRNA表达状态，通过逐级分析成体文昌鱼与现生尾索动物（Urochordata）和脊椎动物（Vertebrata）、microRNA分布关系，推测出脊索动物门基因组可能拥有let-7a、let-7b、miR-125、miR-34、miR-184、miR-33和miR-210等7个microRNA，为研究脊索动物门microRNA的演化起源提供研究基础。
　　腕足动物门（Brachiopoda）是最古老的Bodyplan之一，最早发现于早寒武世，繁盛于志留、泥盆二纪，其后延续至今。多数腕足动物类群现已灭绝，舌形贝（Lingula Bruguire）是仅存的现生腕足动物之一，对探索原口动物与后口动物共同祖先（Protostome-deuterostome ancestor,PDA）的microRNA祖征(Plesiomorphy)状态具有重要的研究价值。本论文中，我们提取成体舌形贝的总RNA,运用东南大学自主研发的AG-100高通量测序平台检测成体舌形贝的microRNA表达状态，逐级分析成体舌形贝与现生触手冠类群（Lophophorata）、冠轮动物（Lophotrochozoa）和所有两侧对称动物的microRNA分布关系。推测出PDA基因组可能拥有let-7、miR-10、miR-133、miR-184和miR-92等5个microRNA，为microRNA在真后生动物（Eumetazoa)亿万年演化历程中的相关变化提供研究基础。
　　本论文还在实验过程中尝试使用了一种新型的microRNA高通量检测方式。该方法是一种高通量测序与微阵列芯片的组合技术。在完成文昌鱼的高通量测序之后，利用末端转移酶将文昌鱼microRNA转移上荧光，制备成microRNA探针，利用制备完成的探针，与完成测序的芯片进行杂交，对杂交信号进行捕获，并进行了相关分析，从理论性和操作性两方面论证了该方案的可行性。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 文昌鱼背景介绍

1．1．1 文昌鱼研究意义

1．1．2 文昌鱼研究进展

1．1．3 本论文研究计划

1．2 舌形贝背景介绍

1．2．1 舌形贝研究意义

1．2．2 舌形贝研究进展

1．2．3 本论文研究计划

1．3 高通量测序技术

1．3．1 高通量测序的产生背景

1．3．2 高通量测序平台的介绍

1．3．3 高通量测序平台的发展远景

1．3．4 AG高通量测序平台介绍

1．4 microRNA检测技术

1．4．1 microRNA介绍

1．4．2 microRNA检测技术

1．4．3 microRNA在物种进化过程中的重要性

1．5 本论文研究意义

第二章 文昌鱼的microRNA检测

2．1 实验材料与实验方法

2．1．1 实验所用材料及设备

2．1．2 样本的前期处理

2．1．3 microRNA文库的建立

2．2 结果与讨论

2．2．1 实验结果及讨论

2．2．2 TBE缓冲液选择

2．2．3 荧光定量PCR实验

2．2．4 反转录接头设计

2．3 本章小结

第三章 舌形贝的microRNA检测

3．1 实验方法与实验材料

3．1．1 实验所用材料及设备

3．1．2 样本的前期处理

3．1．3 microRNA文库的建立

3．2 结果与讨论

3．2．1 实验结果及讨论

3．2．2 荧光定量PCR实验

3．3 本章小结

第四章 生物信息学分析

4．1 非编码RNA筛选

4．1．1 Rfam数据库

4．1．2 构建非编码RNA过滤数据集

4．1．3 非编码RNA筛选

4．2 MicroRNA比对

4．3 比对结果与讨论

4．3．1 文昌鱼microRNA数据比对结果与讨论

4．3．2 舌形贝microRNA数据比对结果与讨论

4．4 本章小结

第五章 高通量微阵列测序杂交组合技术

5．1 高通量微阵列测序杂交组合技术的构想

5．2 实验方法与实验材料

5．2．1 实验所用材料及设备

5．2．2 样本的前期处理

5．2．3 microRNA文库的建立

5．2．4 探针制备

5．3 结果与讨论

5．3．1 文库制备方案

5．3．2 高通量测序

5．3．4 芯片杂交结果

5．3 本章小结

第六章 总结与展望

参考文献

致谢