技术领域
本发明涉及一种延长泡菜保质期的方法，具体涉及一种利用耐低温乳酸菌结合儿茶素延长泡菜保质期的方法。
背景技术
泡菜是我国的传统发酵蔬菜制品，以四川泡菜最具代表性，是以乳酸菌为主导进行厌氧发酵而成，富含以乳酸菌主导的有益微生物，色、香、味俱全，酸爽、开胃，主要是里面含有大量的乳酸、乙酸、乙醇和乙酸乙酯等风味成分。
目前，大多数泡菜都采用自然发酵的模式，其菌群结构复杂，有关泡菜中优势乳酸菌的报道比较多，主要包括植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌、短乳杆菌、魏斯氏菌等。随着我国经济的快速发展，人们对泡菜的品质要求逐步提高，以眉山东坡泡菜为代表的泡菜产业逐渐兴起，主要以工业泡菜为主，发酵后期以高盐进行贮藏加工，产品经过灭菌，保质期长达1年以上，品质稳定，但容易产生高盐废水，且难处理。而传统四川泡菜(又称“洗澡泡菜”)为低盐发酵，可循环进行泡渍，但由于易变色、软化、过酸等，其保质期短，一直不能进行大规模加工。传统泡菜保质期主要通过巴氏杀菌结合防腐剂来延长保质期，部分研究采用接菌发酵调控发酵，但受环境因素影响，效果不明显。
传统四川泡菜以低盐为主，泡渍过程中容易受到杂菌的污染，出现亚硝酸峰，随着泡菜发酵，以肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌为主的乳酸菌丰度和数量增加，快速产酸，泡菜发酵后期以耐酸性强的乳杆菌为主导，主要是植物乳杆菌、短乳杆菌、戊糖乳杆菌等，乳酸菌自身的代谢产物如乳酸、乙酸等使泡菜过酸，泡菜出现软化、变色等，导致泡菜货架期极短，泡菜品质不稳定等；目前传统四川泡菜在4℃环境下保质期只有15-20天左右。
本申请人发现现有技术至少存在以下技术问题：
现有技术中的低盐泡菜保质期较短，在泡菜发酵后期易出现过酸和变色，导致泡菜货架期极短，泡菜品质不稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用耐低温乳酸菌结合儿茶素延长泡菜保质期的方法，以解决现有技术中的低盐泡菜保质期较短，在泡菜发酵后期易出现过酸和变色，导致泡菜货架期极短，泡菜品质不稳定的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种利用耐低温乳酸菌结合儿茶素延长泡菜保质期的方法，包括下述步骤：
(1)多段发酵
采用肠膜明串珠菌和短乳杆菌将新制的泡菜进行一段发酵和二段发酵，二段发酵后泡菜酸度达到0.3％；
(2)泡菜的包装
待步骤(1)中多段发酵后的泡菜进行菜水分离，然后在泡菜液中加入质量比为1％～3％的儿茶素粗提物混合均匀，最后按菜水比1:1～5:1进行真空包装，得到泡菜成品。
进一步的，所述步骤(1)中，所述一段发酵为：将肠膜明串珠菌菌泥加入新制的泡菜中并搅拌均匀，使肠膜明串珠菌的初始数量在10
进一步的，所述步骤(1)中，所述二段发酵为：然后将经过一段发酵后的泡菜坛放入10～13℃恒温箱中，待泡菜温度平衡后加入短乳杆菌菌泥，使短乳杆菌初始数量在10
进一步的，所述步骤(1)中，所述肠膜明串珠菌和短乳杆菌的制备方法为：将低温(5-10℃)泡菜中筛选出的短乳杆菌和肠膜明串珠菌分别经两次活化得到菌悬液，两种菌悬液的活性均≥10
进一步的，所述步骤(2)中，所述儿茶素粗提物的制备方法为：将茶叶进行切碎，加入酒精进行提取，然后将提取液经过过滤、离心、色谱柱洗脱、浓缩、干燥，得到儿茶素粗提物。
进一步的，所述提取为向切碎的茶叶中加入60％～95％酒精溶液，料液比为1：1～1：5，在40～50℃的恒温水浴中超声提取1.8～2.5小时；
所述离心为将过滤所得过滤液在转速为2800～3200r/min离心2～4min，取上清液；
所述色谱柱洗脱为将所得上清液以40～120mL/min通过填充聚酰胺的色谱柱(66mm×550mm)，色谱柱分别用水和60％～95％(v/v)乙醇溶液以35mL/min进行洗脱，收集乙醇洗脱液；
所述浓缩为采用旋转蒸发仪将收集的乙醇洗脱液在40～50℃蒸发10～60min得到浓缩液；
所述干燥为将浓缩液冷冻干燥17～19小时得到儿茶素粗提物。
进一步的，所述步骤(1)中，所述泡菜的制备方法为：将新鲜蔬菜、食盐、老姜、大蒜头、红辣椒、花椒和葡萄糖加入到泡菜坛中，再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀。
进一步的，所述老姜的添加量为新鲜蔬菜总质量的0.5％～1.5％，所述大蒜的添加量为新鲜蔬菜总质量的0.4％～0.6％，所述红辣椒的添加量为新鲜蔬菜总质量的1.5％～2.5％，所述花椒添加量为新鲜蔬菜总质量的0.01％～0.03％，所述葡萄糖添加量为新鲜蔬菜总质量的0.8％～1.8％；再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀，泡菜盐度为2.5％～3.5％。
进一步的，所述老姜的添加量为新鲜蔬菜总质量的1％，所述大蒜的添加量为新鲜蔬菜总质量的0.5％，所述红辣椒的添加量为新鲜蔬菜总质量的2％，所述花椒添加量为新鲜蔬菜总质量的0.02％，所述葡萄糖添加量为新鲜蔬菜总质量的1％；再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀，泡菜盐度为3％。
进一步的，在制备泡菜前，先将制备泡菜的新鲜蔬菜清洗后用质量比为3～10％的食盐水浸泡9～15h，然后切成块状；将泡菜坛清洗并灭菌处理。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
本发明提供的利用耐低温乳酸菌结合儿茶素延长泡菜保质期的方法，采用多段发酵的方式进行发酵，以温度结合多菌剂组合发酵，发酵后的泡菜风味好，酸度适宜，并且能抑制致病微生物生长；并且采用儿茶素增加泡菜的抗氧化性和抑菌性，防止了泡菜过酸和变色；本申请将耐低温乳酸菌与儿茶素相结合，在4℃环境泡菜保质期可以达到30-40天，达到了延长泡菜保质期的目的。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1：
一种利用耐低温乳酸菌结合儿茶素延长泡菜保质期的方法，包括下述步骤：
(1)前处理：
将制备泡菜用的新鲜甘蓝进行筛选，清洗干净，沥干后用质量比为5％食盐水浸泡12h，甘蓝切分成2～4cm大小均一的块状，将泡菜坛清洗干净，然后用开水进行灭菌处理。
(2)泡菜的制备：
将新鲜甘蓝、老姜、大蒜头、红辣椒、花椒和葡萄糖加入到泡菜坛中，其中老姜的添加量为新鲜蔬菜总质量的1％，大蒜的添加量为新鲜蔬菜总质量的0.5％，红辣椒的添加量为新鲜蔬菜总质量的2％，花椒添加量为新鲜蔬菜总质量的0.02％，葡萄糖添加量为新鲜蔬菜总质量的1％，再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀，泡菜盐度为3％，得到新制的泡菜；
(3)菌泥的制备：
将低温(5-10℃)泡菜中筛选出的短乳杆菌和肠膜明串珠菌分别经两次活化得到菌悬液，两种菌悬液的活性均≥10
(4)儿茶素粗提物的制备：
①将茶叶进行切碎，90目过筛；
②向切碎的茶叶中加入80％酒精溶液，料液比为1：2，45℃恒温水浴超声提取2小时；
③过滤，收集滤液；
④将过滤所得过滤液在转速为3000r/min离心3min，取上清液；
⑤将所得上清液以100mL/min通过填充聚酰胺的色谱柱(66mm×550mm)，色谱柱分别用水和80％(v/v)乙醇溶液以35mL/min进行洗脱，收集乙醇洗脱液；
⑥采用旋转蒸发仪将收集的乙醇洗脱液在45℃蒸发20min得到浓缩液；
⑦将浓缩液冷冻干燥18小时得到儿茶素粗提物；
(5)多段发酵：
①一段发酵：将步骤(3)中得到的将肠膜明串珠菌菌泥加入步骤(2)新制的泡菜中并搅拌均匀，使肠膜明串珠菌的初始数量在10
②将经过一段发酵后的泡菜坛放入10℃恒温箱中，待泡菜温度平衡后加入步骤(3)中得到的短乳杆菌菌泥，使短乳杆菌初始数量在10
(6)泡菜的包装：
将步骤(5)中多段发酵后的泡菜进行菜水分离，然后在泡菜液中加入质量比为2％的儿茶素粗提物混合均匀，最后按菜水比3:1进行真空包装，得到泡菜成品，然后置于4℃进行贮藏。
实施例2：
一种利用耐低温乳酸菌结合儿茶素延长泡菜保质期的方法，包括下述步骤：
(1)前处理：
将制备泡菜用的新鲜甘蓝进行筛选，清洗干净，沥干后用质量比为3％食盐水浸泡15h，甘蓝切分成2～4cm大小均一的块状，将泡菜坛清洗干净，然后用开水进行灭菌处理。
(2)泡菜的制备：
将新鲜甘蓝、老姜、大蒜头、红辣椒、花椒和葡萄糖加入到泡菜坛中，其中老姜的添加量为新鲜蔬菜总质量的0.5％，大蒜的添加量为新鲜蔬菜总质量的0.6％，红辣椒的添加量为新鲜蔬菜总质量的1.5％，花椒添加量为新鲜蔬菜总质量的0.03％，葡萄糖添加量为新鲜蔬菜总质量的0.8％，再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀，泡菜盐度为2.5％，得到新制的泡菜；
(3)菌泥的制备：
将低温(5-10℃)泡菜中筛选出的短乳杆菌和肠膜明串珠菌分别经两次活化得到菌悬液，两种菌悬液的活性均≥10
(4)儿茶素粗提物的制备：
①将茶叶进行切碎，90目过筛；
②向切碎的茶叶中加入60％酒精溶液，料液比为1：5，50℃恒温水浴超声提取1.8小时；
③过滤，收集滤液；
④将过滤所得过滤液在转速为3200r/min离心2min，取上清液；
⑤将所得上清液以120mL/min通过填充聚酰胺的色谱柱(66mm×550mm)，色谱柱分别用水和95％(v/v)乙醇溶液以35mL/min进行洗脱，收集乙醇洗脱液；
⑥采用旋转蒸发仪将收集的乙醇洗脱液在50℃蒸发10min得到浓缩液；
⑦将浓缩液冷冻干燥17小时得到儿茶素粗提物；
(5)多段发酵：
①一段发酵：将步骤(3)中得到的将肠膜明串珠菌菌泥加入步骤(2)新制的泡菜中并搅拌均匀，使肠膜明串珠菌的初始数量在10
②将经过一段发酵后的泡菜坛放入13℃恒温箱中，待泡菜温度平衡后加入步骤(3)中得到的短乳杆菌菌泥，使短乳杆菌初始数量在10
(6)泡菜的包装：
将步骤(5)中多段发酵后的泡菜进行菜水分离，然后在泡菜液中加入质量比为3％的儿茶素粗提物混合均匀，最后按菜水比5:1进行真空包装，得到泡菜成品，然后置于4℃进行贮藏。
实施例3：
一种利用耐低温乳酸菌结合儿茶素延长泡菜保质期的方法，包括下述步骤：
(1)前处理：
将制备泡菜用的新鲜甘蓝进行筛选，清洗干净，沥干后用质量比为10％食盐水浸泡9h，甘蓝切分成2～4cm大小均一的块状，将泡菜坛清洗干净，然后用开水进行灭菌处理。
(2)泡菜的制备：
将新鲜甘蓝、老姜、大蒜头、红辣椒、花椒和葡萄糖加入到泡菜坛中，其中老姜的添加量为新鲜蔬菜总质量的1.5％，大蒜的添加量为新鲜蔬菜总质量的0.4％，红辣椒的添加量为新鲜蔬菜总质量的2.5％，花椒添加量为新鲜蔬菜总质量的0.01％，葡萄糖添加量为新鲜蔬菜总质量的1.8％，再向其中加入无菌盐水，并进行搅拌混匀，泡菜盐度为3.5％，得到新制的泡菜；
(3)菌泥的制备：
将低温(5-10℃)泡菜中筛选出的短乳杆菌和肠膜明串珠菌分别经两次活化得到菌悬液，两种菌悬液的活性均≥10
(4)儿茶素粗提物的制备：
①将茶叶进行切碎，90目过筛；
②向切碎的茶叶中加入95％酒精溶液，料液比为1：1，40℃恒温水浴超声提取2.5小时；
③过滤，收集滤液；
④将过滤所得过滤液在转速为2800r/min离心4min，取上清液；
⑤将所得上清液以40mL/min通过填充聚酰胺的色谱柱(66mm×550mm)，色谱柱分别用水和60％(v/v)乙醇溶液以35mL/min进行洗脱，收集乙醇洗脱液；
⑥采用旋转蒸发仪将收集的乙醇洗脱液在40℃蒸发60min得到浓缩液；
⑦将浓缩液冷冻干燥19小时得到儿茶素粗提物；
(5)多段发酵：
①一段发酵：将步骤(3)中得到的将肠膜明串珠菌菌泥加入步骤(2)新制的泡菜中并搅拌均匀，使肠膜明串珠菌的初始数量在10
②将经过一段发酵后的泡菜坛放入10℃恒温箱中，待泡菜温度平衡后加入步骤(3)中得到的短乳杆菌菌泥，使短乳杆菌初始数量在10
(6)泡菜的包装：
将步骤(5)中多段发酵后的泡菜进行菜水分离，然后在泡菜液中加入质量比为1％的儿茶素粗提物混合均匀，最后按菜水比1:1进行真空包装，得到泡菜成品，然后置于4℃进行贮藏。
二、对比例
对比例1：
以现有技术中自然发酵的方式制备泡菜，得到泡菜成品。
三、实验例：
1、感官评价：
由6名经过训练的研究人员来对实施例1～实施例3以及对比例1贮藏初始(0周)、1周、2周、3周和4周的泡菜进行感官评价，评价指标包括酸度、脆度、口感、香气和色泽。采用5分制(1分为最不喜欢，5分为最喜欢，3分为基本可接受)进行评价(6名研究人员的平均分为评价结果)，将感官评价中脆度、色泽、香气都低于2分的泡菜评判为不合格，评价结果如下表1所示：
表1感官评价结果
从表1可以看出，对比例1中的泡菜贮藏过程中品质逐渐变差，其中酸度逐渐增加，导致过酸，脆度下降，色泽变暗，感官变差；而实施例1～实施例3中，当包装的泡菜中添加儿茶素粗提物后，泡菜的抑菌性和抗氧化性得到提高，强有力的抑制了泡菜中乳酸菌产酸，酸度出现长时间的稳定，口感较好，能延长泡菜的保质期。
2、包装产品特性分析：
对实施例1～实施例3以及对比例1的泡菜贮藏初始(0周)、1周、2周、3周，4周的泡菜中乳酸菌数量、pH和总酸含量进行分析；其中乳酸菌数量采用倾倒法在MRS琼脂培养基中37℃培养48小时计数；pH用PHS～3C型pH计进行测定；总酸测定参考GB/T12456—90《食品中总酸的测定方法》中电位滴定法，用0.05mol/L盐酸标准滴定溶液反滴定至pH为8.2，以乳酸计，测定结果下表2所示：
表2产品特性分析结果
从表2可以看出，对比例1中的泡菜贮藏过程中乳酸菌数量逐渐下降，贮藏4周后达到5log/CFU，大量乳酸菌的生存，使泡菜总酸含量逐渐提高，pH快速下降，泡菜品质降低；实施例1中的泡菜贮藏4周后达到2log/CFU，乳酸菌数量被大大抑制和降解，使泡菜总酸含量保持稳定，pH下降缓慢，泡菜品质维持稳定。结果和感官评定相对应。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
机译： 乳酸菌发酵香肠具有泡菜质地，通过将常见香肠与乳酸菌发酵来增强保质期和质感
机译： 利用米糠培养基发酵泡菜乳酸菌的方法及由此产生的泡菜乳酸菌
机译： 利用天麻，辣椒辣椒乳酸菌发酵液生产泡菜调味料的方法及相同方法生产的泡菜调味料
