一株低产尿素、产风味的库德里阿兹威毕赤酵母及其在食品发酵中的应用

摘要

本发明公开了一株低产尿素、产风味的库德里阿兹威毕赤酵母及其在食品发酵中的应用，属于酒类酿造以及食品安全领域。本发明的库德里阿兹威毕赤酵母是从白酒发酵环境(大曲)中分离得到，命名为Pichia kudriavzevii JZ523，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年5月6日，保藏编号为CGMCC NO.12418。本发明的菌株具有低产尿素、产风味，耐酒精、耐酸的特征，是优良的酿酒功能菌株，可应用于酿造酒、蒸馏酒及其它食品领域，保证食品安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及一株低产尿素、产风味的库德里阿兹威毕赤酵母及其在食品发酵中的应用，属于酒类酿造以及食品安全领域。

背景技术

传统食品在发酵过程中会不可避免地产生一种代谢副产物，即氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)。氨基甲酸乙酯的产生是由于发酵过程中微生物代谢所产生的或来自原料当中的尿素、瓜氨酸等与乙醇自发发生化学反应所形成的。形成EC的前体物质主要有尿素，氰化物以及瓜氨酸，而尿素是目前公认的酒精饮料当中EC形成的主要前体物质，如黄酒，葡萄酒等。在中国白酒发酵过程中，EC形成的主要前体物质也被证实是尿素，其在酒醅中的含量为26～80mg/kg。

尿素主要是由酵母代谢精氨酸所产生的，由于国外的酒精饮料大多是单菌发酵或者少数菌株共同参与的发酵，而酿酒酵母在发酵过程中发挥主体作用。因此，大多数的研究集中在酿酒酵母，并得出酿酒酵母是饮料酒中尿素产生的主要菌株。然而，许多发酵食品属于多菌种发酵，除酿酒酵母外，还有非酿酒酵母的参与，并在发酵过程中发挥重要作用。库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，原名东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)，在发酵过程具有产多种酸的特点，是各种酒风味的重要前体，并且在食品生产过程中，Pichia kudriavzevii是重要的菌株，如在白酒酿造过程中，其所占的比例为14.23％-66.71％。研究也发现Pichia kudriavzevii具有产风味的特点，因此，在发酵过程中，经常通过添加Pichia kudriavzevii菌株来改善食品的风味。如在芝麻香型麸曲白酒生产中，会通过添加库德里阿兹威毕赤酵母麸曲，改善风味。

最近研究发现，Pichia kudriavzevii为重要的尿素产生菌株，其在发酵过程当中所产生的大量尿素会导致发酵过程中EC的形成，从而产生安全问题。因此，获取低产尿素且具有产风味功能并能适应多种食品生产环境的Pichia kudriavzevii，对于以酵母作为主要功能微生物的发酵食品的生产就显得尤为重要，对于食品安全具有重要贡献。

发明内容

为了解决上述问题，本发明筛选得到了一株低产尿素的库德里阿兹威毕赤酵母Pichia kudriavzevii，是从多种香型白酒发酵环境(大曲)当中筛选的。该菌株是从中国白酒酿造过程中获得，具有低产尿素、产风味、产酒精、耐酸等特性，是优良的酿酒功能菌株，能够有 效应用于酿造酒、蒸馏酒、配制酒及其它食品领域，降低食品发酵过程尿素和EC的形成，从而解决食品安全问题。

本发明的第一个目的是提供一株Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株，于2016年5月6日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.12418。

所述Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株是从白酒自然发酵过程中(大曲)分离筛选得到的。

所述Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株，低产尿素且具有产风味功能并能适应食品发酵环境。

所述Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株，可通过所有适合酵母生长的的培养基进行培养(其中在WL固体培养基上生长菌落如图1)。培养方式选用静置培养或振荡培养，温度4-46℃，培养时间足够微生物的生长即可。

所述Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株，经高粱培养基发酵48h后代谢风味物质为：乙酸，丙酸，2-甲基丙酸，丁酸，己酸，庚酸，壬酸，癸酸，2-甲基丙醇，3-甲基丁醇，苯乙醇，香叶醇，橙花叔醇，金合欢醇，α-松油醇，香茅醇，芳樟醇，3-甲硫基-正丙醇，苄醇，乙酸乙酯，乙酸异戊酯，苯丙酸乙酯，苯乙酸乙酯，金合欢烯，β-大马酮，香叶基丙酮。

所述Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株，生长温度范围为4-46℃，适温为25-42℃；生长pH范围为2.3-12.0，优选4.0-8.0，可在分别含60％的葡萄糖、2.0％KCl以及12％乙醇的环境生长。

本发明的第二个目的是提供含有所述Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株的微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌体的活细胞、冷冻干燥得到的Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418干菌体、固定化的Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418细胞、Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418的液体菌剂、Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株。这些形式的Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株，均能在乙醇浓度0-14％，温度10-42℃，糖浓度0-60％及pH 2.3-11进行培养，并能产风味。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任何可以应用于食品或者食品制备的任意种属的菌株，比如地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等等。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418的液体菌剂的 制作方法，是将Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株接种于液体酵母菌剂培养基中，于30℃培养24h；所述液体酵母菌剂培养基配方为A或者B；其中，

A：以g/L计，含有酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、其余为水；

B：以白酒酿造所用的原料为培养基成分，原料经粉碎后，按原料与水的比例为1:1-1:4w/v的比例混合，蒸煮1-5h，冷却后加入糖化酶10-50单位/g原料，于40-80℃保持2-10h，过滤，离心所得滤液调节糖度为10-150Bx、pH为4-6；其中，原料为高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮中的任意一种或者多种以任意比例的混合。

在本发明的一种实施方式中，所述Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418的固体菌剂的制作方法，是将活化后的菌株以10％接种比例接种于固体酵母菌剂培养基中，30℃培养24-36h；所述液体酵母菌剂培养基配方为C或D；其中，

C：原料为高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮中的任意一种或者多种以任意比例的混合；原料经粉碎后，按原料与水的比例为1:0.5-1：2w/v的比例混合后，80-100℃蒸煮30min；

D：在高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮中的任意一种或者多种以任意比例的混合得到的发酵原料，80-100℃蒸煮30min，并加入0.1-1mol/L NaOH溶液调节酸度为0-5。

本发明的第三个目的是提供所述Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株的应用，是应用于食品技术领域，尤其是发酵食品技术领域。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是应用于酿造酒、蒸馏酒等方面，比如白酒、葡萄酒、黄酒、果酒方面，尤其是芝麻香型麸曲白酒。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株添加到白酒、葡萄酒、黄酒或者果酒酿造过程中。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是将Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株添加到种子(曲或者种子培养液)中，比如添加到酵母麸曲中。

本发明的第四个目的是提供一种降低EC的方法，所述方法是将Pichia kudriavzevii CGMCC NO.12418菌株添加到食品制备过程中。

本发明的有益效果：

本发明得到了一株低产尿素、产风味、耐酒精、耐酸的Pichia kudriavzevii菌株，利用该酵母在酿造酒、蒸馏酒及其它食品领域的应用可在一定程度上减少尿素和EC的形成。本发明的菌株，可在分别含60％的葡萄糖、2.0％KCl以及12％乙醇的环境生长，尿素产量远远低于现有的其他Pichia kudriavzevii菌株，而且产风味能力强。本发明菌株在发酵过程中尿素产生的最大值为227.42μg/L，远低于其他同种的菌株，比如模式菌株的最大值为3451.34μg/L。

生物材料保藏

库德里阿兹威毕赤酵母，分类学命名为库德里阿兹威毕赤酵母Pichia kudriavzevii，于2016年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12418，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

附图说明

图1：Pichia kudriavzevii JZ523酵母在WL培养基上的菌落形态；

图2：Pichia kudriavzevii JZ523酵母26S rDNA扩增凝胶电泳图；其中A为模式菌株Pichia kudriavzevii NRRL Y-5396(中国普通微生物菌种保藏中心)扩增结果，B为Pichia kudriavzevii JZ523扩增结果，M为2000DL maker；

具体实施方式

实施例1：低产尿素的酵母Pichia kudriavzevii的筛选及鉴定

取10g大曲溶于100ml无菌生理盐水中，摇床振荡30min后进行梯度稀释，涂布WL固体平板，根据平板上菌落形态特征(图1)，挑取Pichia kudriavzevii酵母单菌落进行高通量液体发酵，对获得的潜在的低产尿素Pichia kudriavzevii酵母进行分子生物学鉴定，利用酵母特异分类鉴定引物NL1和NL4分别扩增酵母的26S rDNA的片段，凝胶电泳检测(图2)。随后进行测序比对，确定所筛选得低产尿素的酵母在分类学上都属于Pichia kudriavzevii酵母。最终所得到一株低产尿素的库德里阿兹威毕赤酵母，命名为Pichia kudriavzevii JZ523。将Pichia kudriavzevii JZ523保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12418。

WL培养基：酵母浸粉4.0g/L，胰蛋白陈5.0g/L，葡萄糖50.0g/L，磷酸二氢钾0.55g/L，氯化钾0.425g/L，氯化钙0.125g/L，硫酸镁0.125g/L，氯化铁0.0025g/L，硫酸锰0.0025g/L，琼脂20g/L，嗅甲酚绿22mg/L。

实施例2：菌株代谢产风味的功能

种子培养基：取25ml试管，装入5ml高粱培养基，并接种上述实施例1获得的菌株Pichia kudriavzevii JZ523，自然pH，30℃，200rpm，进行好氧培养48h。

发酵培养基：将培养好的种子培养液接种在装有50ml高粱培养基的250ml三角瓶中，自然pH，接种量为5％，30℃，200rpm，发酵48h。

运用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)方法对挥发性产物进行分析，取8mL样品，放入装有3g NaCl的顶空进样瓶中，加入10μL浓度为42.60mg/L的4-甲基-2-戊醇为内标。将顶空瓶于50℃恒温萃取45min，萃取完后进行GC-MS分析。

上述实施例1获得的菌株，其发酵48h后代谢产风味的能力为：乙酸168μg/L，丙酸82μg/L，2-甲基丙酸3510μg/L，丁酸78μg/L，己酸655μg/L，庚酸172μg/L，壬酸1456μg/L，癸酸142μg/L，2-甲基丙醇319μg/L，3-甲基丁醇12403μg/L，苯乙醇24322μg/L，香叶醇23.8μg/L，橙花叔醇16.8μg/L，金合欢醇173.2μg/L，α-松油醇2.5μg/L，香茅醇8.8μg/L，芳樟醇3.3μg/L，3-甲硫基-正丙醇49μg/L，苄醇17μg/L，乙酸乙酯158μg/L，乙酸异戊酯110μg/L，苯丙酸乙酯264μg/L，苯乙酸乙酯11μg/L，金合欢烯4.2μg/L，β-大马酮3.2μg/L，香叶基丙酮4.8μg/L。

实施例3：Pichia kudriavzevii JZ523酵母低产尿素

种子培养基：取25ml试管，装入5ml高粱培养基，并接种上述实施例1获得的菌株，自然pH，30℃，200rpm，进行好氧培养48h。

发酵培养基：将培养好的种子培养液接种在装有50ml高粱培养基(添加500mg/L的精氨酸前体物质以及2％乙醇)的250ml三角瓶中，接种量为5％，30℃，200rpm，发酵96h，测定发酵过程中酵母生长情况(OD₆₀₀)和尿素生成情况。发现该菌株在发酵过程24h进入稳定期(OD₆₀₀为1.8)，发酵过程中尿素产量达到的最大值为227.42μg/L(48h)。

尿素检测：采用柱前衍生高效液相色谱荧光检测器(HPLC-FLD)进行测定发酵液尿素的含量。具体操作为：500μl发酵液加入500ml的无水乙醇，400μl9-羟基吨溶液以及100μl的0.1M盐酸溶液，摇匀，室温避光衍生30min。

实施例4：Pichia kudriavzevii JZ523与Pichia kudriavzevii NRRLY-5396产尿素情况对比

种子培养基：取25ml试管，装入5ml高粱培养基，并接种上述实施例1获得的菌株以及模式菌株Pichia kudriavzevii NRRL Y-5396(中国普通微生物菌种保藏中心，(菌种编号2.1876))，自然pH，30℃，200rpm，进行好氧培养48h。

发酵培养基：将培养好的种子培养液接种在装有50ml高粱培养基(添加500mg/L的精氨酸，2％乙醇)的250ml三角瓶中，接种量为5％，30℃，200rpm，发酵96h，测定发酵过程中酵母生长情况(OD₆₀₀)以及尿素生成情况。发现本发明的Pichia>

尿素检测：采用柱前衍生高效液相色谱荧光检测器(HPLC-FLD)进行测定发酵液尿素 的含量。具体操作为：500μl发酵液加入500ml的无水乙醇，400μl9-羟基吨溶液以及100μl的0.1M盐酸溶液，摇匀，室温避光衍生30min。

实施例5：Pichia kudriavzevii JZ523与其他酵母产尿素的情况

本实施例所包括的菌株有Saccharomycopsis fibuligera，Millerozyma farinosa，Trichosporon asahii，Hanseniaspora osmophila，Pichiafermentans，Pichia membranifaciens和Clavispora lusitaniae，以及本发明的菌株Pichia kudriavzevii JZ523。这7种菌株都来自白酒酿造环境。

种子培养基：取25ml试管，装入5ml高粱培养基，并接种Pichia kudriavzevii JZ523菌株以及Wickerhamomyces anomalus，Saccharomycopsis fibuligera，Millerozyma farinosa，Saccharomyces cerevisiae，Trichosporon asahii，Hanseniaspora osmophila，Pichiafermentans，Pichia membranifaciens和Clavispora lusitaniae，自然pH，30℃，200rpm，进行好氧培养48h。

发酵培养基：将培养好的种子培养液接种在装有50ml高粱培养基(添加500mg/L的精氨酸，2％乙醇)的250ml三角瓶中，接种量为5％，30℃，200rpm，发酵96h，测定发酵过程中酵母生长情况(OD₆₀₀)以及尿素生成情况。通过比较发酵6h尿素的产量与OD₆₀₀，发现这8株酵母的在发酵6h时单位时间内尿素的产量分别为：Pichia>

这说明本发明的菌株Pichia kudriavzevii JZ523的尿素产生的能力明显小于其他从白酒发酵环境当中分离得到的酵母。

实施例6：菌株生理生化性质

生长温度范围为4-46℃，适温为25-33℃；生长pH范围为2.3-12.0，优选4.0-8.0，可在分别含60％的葡萄糖、2.0％KCl以及12％乙醇的环境生长中。

将上述实施例1获得的Pichia kudriavzevii JZ523菌株，接种于YPD液体培养基中，30℃培养24h，然后用无菌生理盐水稀释至OD₆₀₀为1，吸取0.5ml菌液至50ml耐受性培养基中。

温度耐受性培养基：YPD培养基，分别于30℃，37℃，40℃，42℃以及46℃进行静止培养48h。结果显示本发明的Pichia kudriavzevii JZ523菌株能够在温度范围为30-46℃进行生长。

酸度耐受性培养基：YPD培养基，用0.1M HCl调节培养基pH，使其成pH分别为2.9，2.7，2.5，2.4，2.3，于30℃进行静置培养48h。结果显示本发明的Pichia kudriavzevii JZ523菌株能够在pH范围为2.9-2.3进行生长。

酒精度耐受性培养：YPD培养基，加入酒精，使其成酒精度含量分别为0，4％，6％，8％，10％，12％，14％，于30℃进行静置培养48h。结果显示本发明的Pichia kudriavzevii JZ523菌株能够在酒精度范围为0-12％进行生长。

糖度耐受性培养基：YPD培养基，加入不同质量的葡萄糖，使其成葡萄糖浓度分别为1％,40％，50％，60％，65％，70％，于30℃进行静置培养48h。结果显示本发明的Pichia kudriavzevii JZ523菌株能够在葡萄糖浓度范围为0-60％进行生长。

渗透压耐受性培养基：YPD培养基，加入不同质量的KCl，使其KCl浓度分别为0，0.7mol/L，1mol/L，1.4mol/L，1.7mol/L，2mol/L，于30℃进行静置培养48h。结果显示本发明的Pichia kudriavzevii JZ523菌株能够在KCL范围为0-2mol/L进行生长。

实施例7 Pichia kudriavzevii JZ523在芝麻香白酒中的应用

将本发明的菌株Pichia kudriavzevii JZ523制作成液体菌剂，其制作方法是将Pichia kudriavzevii JZ523菌株接种于液体酵母菌剂培养基中，于30℃培养24h；所述液体酵母菌剂培养基配方为A或者B；其中，

A：以g/L计，含有酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、其余为水；

B：以白酒酿造所用的原料为培养基成分，原料经粉碎后，按原料与水的比例为1:1-1:4w/v的比例混合，蒸煮1-5h，冷却后加入糖化酶10-50单位/g原料，于40-80℃保持2-10h，过滤，离心所得滤液调节糖度为10-150Bx、pH为4-6；其中，原料为高粱、大麦、小麦、豌豆、麸皮中的任意一种或者多种以任意比例的混合。

将液体菌剂添加进入芝麻香白酒麸曲制作的原料当中，等麸曲制作完成之后，加入酒醅当中进行发酵，发酵完成后，检测白酒生产发酵后期酒醅及原酒里面尿素与EC的含量，发现添加Pichia kudriavzevii JZ523的麸曲，在进行生产时，能显著减少酒醅和原酒中尿素20～50％，同时，EC减少量为15～45％，原酒里面EC的减少量为15％～35％，说明添加权利一所述的菌株确实能达到减少食品当中尿素及EC的含量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。