一种联产尿苷和乙偶姻的发酵生产方法

摘要

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种联产尿苷及乙偶姻的发酵生产方法。现有的技术大多利用枯草芽孢杆菌单独生产尿苷或者乙偶姻，并且产量水平都不高，存在原料利用率低，成本高的问题，本发明提供了一株通过诱变选育出来的具有工业化应用潜力的枯草芽孢杆菌及其相应的发酵工艺，可以联产尿苷及乙偶姻，产量分别达到尿苷25-32g/L，乙偶姻50-65g/L。大大提高原料的利用率，降低成本，从而缓解资源和环境压力。

说明书

技术领域：

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种联产尿苷及乙偶姻的发酵生产方 法。

背景技术：

尿苷是构成尿苷酸的前体，而后者可以合成肝脏解毒物质葡萄糖醛酸。尿苷酸钠 不仅可以作为调味品和制药原料，还可作为食品添加剂添加到奶粉中，大幅度提高婴儿的 免疫力。除此之外，尿苷可用于巨型红血球贫血，也可与其他核苷、碱基合用于治疗肝、脑血 管及心血管等疾患。动物试验表明，它与肌苷合用能够促进心肌细胞代谢，加速蛋白质、核 酸的生物合成及能量产生，改善和促进脑细胞代谢循环。尿苷用于医药领域，可以修复导致 疾病的破损基因，提高机体抗体水平。它的更重要的一个用途是作为医药中间体生产一些 抗病毒抗肿瘤药物，如碘苷、溴苷、氟苷等，能够阻断各种癌细胞和病毒的基因合成，治疗癌 症或病毒引起的疾病。

尿苷的生产方法有化学合成法，水解RNA法和微生物发酵法，微生物发酵法因其周 期短、易控制、产率高、污染小等优点，具有大规模工业化的潜力，因此日益受到人们的重 视。发酵法生产尿苷的研究始于20世纪60年代，日本武田化学公司从上世纪八十年代开始， 对尿苷的发酵菌种选育和发酵工艺优化进行了一系列的研究并取得了丰硕的成果，其报道 的研究成果代表了发酵法生产尿苷的最高水平，武田公司尿苷发酵生产的研究过程如下： 在高产尿苷菌种选育的过程中先以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，经过NTG诱变，选育出 一株尿嘧啶缺陷型菌株No.122，该菌株在提供50mg/L尿嘧啶情况下，能够积累乳清酸 8.58g/L(50mM)乳清酸和7.78g/L(27mM)乳清酸核苷；在No.122的基础上，再次经过NTG诱 变，在含有300mg/L6-氮杂尿嘧啶的培养基中筛选到菌株No.258，此菌株积累尿苷10g/L， 尿嘧啶7g/L。继续NTG诱变，在含有5g/L的6-氮杂尿嘧啶培养基中筛选到菌株No.508，该菌 株积累尿苷46g/L，尿嘧啶6g/L。最后，为了降低副产物尿嘧啶的积累量，继续进行诱变，筛 选到一株尿苷磷酸化酶几乎活性丧失的菌株No.556，能够积累尿苷55g/L，尿嘧啶积累量＜ 1g/L；最后通过对培养条件及培养基成分的优化，在6000L发酵罐中稳定积累尿苷65g/L。

B.subtilis有两种氨甲酰磷酸合成酶(EC6.3.5.5，carbamoylphosphate synthetase，CPSase)：一是pyrAA/pyrAB基因编码，催化UMP从头合成途径的第一步反应；二 是carA/carB基因编码，参与精氨酸生物合成。虽然，这两种氨甲酰磷酸合成酶都催化谷氨 酰胺与CO₂反应，消耗2分子ATP生成氨甲酰磷酸。但是，B.subtilis的两个氨甲酰磷酸合成 酶生理功能不同，它们的表达和酶活性调节机制也完全不同。

pyrAA/pyrAB位于pyr操纵子的第5和6位，编码与UMP合成相关的氨甲酰磷酸合成 酶。其中pyrAA基因长度为1095bp，编码氨甲酰磷酸合成酶的小亚基，催化谷氨酰胺的ε-氨 基转移到大亚基。pyrAB基因长度为3216bp，编码氨甲酰磷酸合成酶的大亚基，催化MgATP、 CO₂与NH₃合成氨甲酰磷酸。pyrAA/pyrAB属于pyr操纵子，其表达也受PRPP激活，受UMP、UDP和 UTP的反馈阻遏。pyrAA/pyrAB编码的氨甲酰磷酸合成酶还是一个变构酶，其酶活受UMP反馈 抑制，受PRPP激活，并需要Mg²⁺的存在。

嘧啶核苷高产菌株选育的难点在于解除终产物的反馈阻遏和反馈抑制作用，特别 是反馈抑制作用的解除，虽然研究人员已经揭示了嘧啶核苷合成代谢具体的调控机制，并 从分子层面上阐述了嘧啶操纵子受终产物阻遏的机理，但是对于受终产物反馈抑制的氨甲 酰磷酸合成酶具体的调控位点却并不清楚。

目前国内还没有发酵法生产尿苷的先例，有关尿苷发酵生产的研究起步较晚，进 展也较缓慢，同国外相比还存在很大差距。

乙偶姻化学名为3-羟基丁酮，天然存在于葡萄、可可、香蕉、玉米、干酪和肉类等许 多食品中。它是一种广泛应用的食用香料，主要用于奶油、乳品、酸奶等香料的生产。作为一 种食用香料，我国GB2760-86规定为允许食用，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。 同时，乙偶姻作为一种重要的四碳平台化合物，被美国能源部列为30种优先被开发利用的 平台化合物之一，特别是手性乙偶姻作为高附加值化学品，可广泛应用于手性药物和化学 中间体的合成。此外，乙偶姻还可用于修饰青霉素、氨苄青霉素等抗生素类药物，以提高药 效，降低副作用等，从而引起医药工业的重视。

乙偶姻的生产方法主要包括化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。乙偶姻的化 学合成法主要是丁二酮部分加氢还原和2,3-丁二醇选择性氧化生产；乙偶姻的酶转化法主 要是通过分离纯化丁二酮还原酶，催化丁二酮还原，得到乙偶姻，也可通过乙偶姻还原酶与 NADH氧化酶催化2,3-丁二醇氧化获得。但是丁二酮和2,3-丁二醇并非大宗化工产品，它们 均来源于石油等不可再生石化资源，因此原料来源不足、环境污染严重、工艺复杂、产品质 量要求等限制了化学合成法的大规模发展，不符合可持续发展的潮流，因此微生物发酵法 生产乙偶姻是目前研究的热门。

目前已有多种微生物天然或经代谢改造之后具备产乙偶姻的能力，东华大学的孙 建安等利用粘质沙雷氏菌，以蔗糖为碳源发酵生产75g/L的乙偶姻，为目前报道的发酵法产 乙偶姻的最高产量。乙偶姻在食品、医药等领域的广泛应用，也使得产乙偶姻安全菌种的开 发成为乙偶姻菌种选育的热门，枯草芽孢杆菌作为安全菌株，天然具备产乙偶姻的能力，是 发酵法生产乙偶姻的常选菌株。

现有的技术大多利用枯草芽孢杆菌单独生产尿苷或者乙偶姻，并且产量水平都不 高，存在原料利用率低，成本高的问题，本发明提供了一株通过诱变选育出来的具有工业化 应用潜力的枯草芽孢杆菌及其相应的发酵工艺，可以联产尿苷及乙偶姻，大大提高原料的 利用率，降低成本，从而缓解资源和环境压力。

发明内容：

本发明的目的是提供一种可以联产尿苷和乙偶姻的发酵生产方法，克服现有技术 中尿苷和乙偶姻单独生产，原料利用率低、产量低和工艺复杂的缺陷。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种联产尿苷和乙偶姻的发酵生产方法，生产菌种经斜面培养和种子培养后进入 发酵培养，发酵培养采用分批流加补料工艺，接种量为10％-15％，培养温度为34-38℃，pH 6.7-7.0，相对溶氧控制在10％-30％，发酵过程中流加甘油酵母粉混合水溶液，甘油的含量 控制在5-15g/L，发酵周期为52-60小时；

所述甘油酵母粉混合水溶液为含800g/L甘油和60g/L酵母粉的混合水溶液；

所述pH通过0.5M氢氧化钠溶液和豆粕水解液调节；

所述发酵培养的培养基组成为：酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，K₂HPO₄5.2g/L，柠檬酸钠10g/L，谷氨酸钠20g/L，玉米浆20mL/L，CaCl₂1g/L，尿素20g/L，MgSO₄· 7H₂O5g/L，MnSO₄0.02g/L，ZnSO₄0.02g/L；pH6.7～7.0，115℃，灭菌15min；

所述生产菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)A260，该菌株已于2015年12 月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.11775。

所述枯草芽孢杆菌A260是以一株积累嘧啶核苷的枯草芽孢杆菌为出发菌株，通过 常压室温等离子诱变和嘧啶核苷结构类似物抗性菌株筛选而选育出来的，具体步骤如下： 以产嘧啶核苷的枯草芽孢TD131为出发菌株，进行常压室温等离子诱变，然后在含300mg/L 2-硫尿嘧啶基本培养基上筛选出菌株T823，接着以T823为出发菌株，通过常压室温等离子 诱变后，在含有100mg/L6-氮杂尿嘧啶基本培养基上筛选出菌株A260。

对突变株A260的嘧啶核苷操纵子进行测序，并与出发菌株TD131进行序列对比，发 现突变株A260的氨甲酰磷酸合成酶的编码基因发生突变，突变位点在大亚基(调控位点所 在亚基，由pyrAB基因编码)上，A260中pyrAB基因第2846、2847和2848位碱基缺失，最终导致 氨甲酰磷酸合成酶大亚基的949位的谷氨酸缺失(E949*)，而该菌株菌嘧啶核苷操纵子其它 基因未发现突变，且与乙偶姻合成相关的基因也未发现突变。

原始pyrAB基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；

原始氨甲酰磷酸合成酶大亚基氨基酸序列如序列表SEQIDNo.3所示；

突变pyrAB基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示；

氨甲酰磷酸合成酶大亚基突变体氨基酸序列如序列表SEQIDNo.4所示；

本发明中核苷酸的位置编号对应序列表SEQIDNo.1所述核苷酸序列；

本发明中氨基酸的位置编号对应序列表SEQIDNo.3所述氨基酸序列。

有益效果：

1、本发明提供了一种联产尿苷和乙偶姻的发酵生产工艺，最终利用本发明所提供 的发酵工艺发酵结束后，发酵液中能够积累尿苷25-32g/L，乙偶姻50-65g/L。

2、本发明提供了一株能够联产尿苷和乙偶姻的枯草芽孢杆菌A260，A260是以一株 积累嘧啶核苷的枯草芽孢杆菌为出发菌株进行诱变的，却获得了高产乙偶姻的意外效果， 且乙偶姻发酵液产量高达50－65g/L，优于现有技术。

3、本发明通过诱变获得的菌株A260在经过发酵条件优化后尿苷产量可达30-32g/ L，是出发菌株TD131尿苷产量(4.1±0.5g/L)的7.2倍。

附图说明：

图196微孔板筛选结果

图2摇瓶筛选结果

图3A260发酵联产尿苷和乙偶姻过程曲线

具体实施方式：

实施例1.枯草芽孢杆菌A260的筛选

本发明将初始菌株TD131经常压室温等离子诱变-结构类似物抗性筛选-高通量筛 选-摇瓶复筛，获得菌株A260，具体过程如下：

1.出发菌株：B.subtilisTD131

2.常压室温等离子诱变

(1)菌体培养方法：保菌管接LB平板，三区划线，37℃培养12h；从平板上挑单菌落 接LB摇管，37℃，200rpm，培养12h；摇管转接LB摇瓶，接种量为1％，37℃，200rpm，培养4-6h。

(2)菌悬液的制备方法：离心收集培养好的菌体，无菌生理盐水洗涤2-3次后，再用 无菌生理盐水适量稀释制成OD₆₀₀值在0.6-0.8的菌悬液，取10μL菌悬液涂在载片上待处理。

(3)ARTP诱变：ARTP处理参数为：载片处于气流端口2mm处；功率为120W；气流量为 10SLM；作用时间为25s。

3.结构类似物抗性突变株的筛选

将经过ARTP诱变处理后的菌悬液涂布在含有一定浓度结构类似物的基本培养基 平板上，37℃培养24h后，菌落较大的菌株为可能的目标突变菌株。

4.高通量筛选嘧啶核苷高产菌

从结构类似物抗性平板上挑取大菌落点接到已做好标记的LB平板上，并转接入已 灭菌并盛有400微升无菌LB培养基的深孔中，LB平板37℃过夜培养后，4℃保藏，作为进一步 的筛选用。平板36℃，200rpm，培养10h后，以10％的接种量，一一转接种到盛有400微升孔板 发酵培养基的无菌新孔板中，36℃,200rmp，培养30h。培养结束后，离心发酵样品，将上清稀 释100倍后，分别取200微升到酶标板中，用酶标仪检测样品在270nm下的吸光值OD₂₇₀，将 OD₂₇₀较高菌株进行保藏，进行进一步的摇瓶复筛。图1为微孔板筛选结果。

5.摇瓶复筛

(1)培养基：

活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂 20，pH6.7～7.0，0.1MPa，20min。

种子培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉5，蛋白胨10，硝酸钠15，磷酸二氢钾1，磷酸氢 二钾5.2，硫酸镁1，柠檬酸钠1，pH6.7～7.0，0.075MPa，15min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，酵母粉5，蛋白胨10，硝酸钠15，磷酸二氢钾1，磷酸 氢二钾5.2，硫酸镁1，柠檬酸钠1，pH6.7～7.0，0.075MPa，15min。葡萄糖分消。

(2)培养方法：

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。

种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角 瓶中，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养6h。

发酵培养：吸取3mL种子液接种于装有27mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中，九 层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养30h。

(3)分析方法：

pH测定：采用pH6.4-8.0精密pH试纸测定。

生物量测定：发酵过程中，将发酵液适当稀释后用分光光度计测定600nm处的吸光 度值OD600，来表征菌体生长情况。

残糖测定：室温下将发酵液于13000r/min离心2min，取上清液10μL加入至990μL去 离子水中充分混匀，然后取25μL采用SBA-40E系列生物传感分析仪测定其残糖量，所测值即 为发酵液中的残糖量，单位为g/L。

嘧啶核苷浓度测定：取离心后的发酵液上清液100μL加入到900μL去离子水中，以 1g/L标准样品为参比并作相同的稀释处理，全部样品经过0.45μm滤膜过滤后采用HPLC测定 发酵液中嘧啶核苷产量。采用的色谱柱为PhenomenexGemini5uC18110A150*4.6mm，柱 温30℃，流动相为乙腈：水＝2：98，流速1mL/min，每个样品进样10μL，分析时间12min。

图2为摇瓶筛选的结果。

6.5L发酵罐的发酵验证.

实施例2突变株A260对不同结构类似物的耐受性检测

(1)检测方法：从保菌管中取10微升菌液接LB摇管，37℃，200rpm，培养10-12小时， 离心收集培养好的菌体，无菌生理盐水洗涤2-3次后，在用无菌生理盐水梯度稀释十万倍， 然后取100微升菌液分别涂布于含有不同浓度结构类似物基本培养基平板上，每个浓度三 个平行，对照为基本培养基平板(不含结构类似物)。37℃培养24h后，对平板所长菌落数进 行统计，菌落数的多少反映耐受性的高低。一定时间内能够在高浓度抗性平板上长出大量 菌落说明此菌株对该结构类似物的耐受能力强。

基本培养基(g/L)：硫酸铵3，磷酸氢二钾1，水解酪素3，VB₁、VB₃、VB₅、VB₁₃、VH各 0.1mg，MgSO₄·7H₂O0.1，ZnSO₄·7H₂O、MnSO₄·7H₂O各2mg，色氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮 氨酸各0.1g，葡萄糖10，琼脂20，其中葡萄糖配制成800g/L的溶液，0.075MPa，15min灭菌，其 余0.1MPa，20min灭菌。

(2)检测结果：

表1：两株菌对不同嘧啶核苷结构类似物的耐受性检测结果

从检测结果来看A260与出发菌株TD131相比，对2-硫尿嘧啶的耐受能力分别提高 了大约23.3倍；对6-氮杂尿嘧啶的耐受性提高了大约30倍；对5-氟尿嘧啶的耐受能力提高 了大约200倍。

实施例3突变株A260联产尿苷和乙偶姻的发酵工艺

(1)培养基：

活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂 20，pH6.7～7.0，灭菌条件：121℃，20min

种子培养基(g/L)：葡萄糖40，酵母粉5，蛋白胨10，硝酸钠15，磷酸二氢钾1，磷酸氢 二钾5.2，硫酸镁1，柠檬酸钠1，pH6.7～7.0，灭菌条件：115℃，15min。

发酵培养基：酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，K₂HPO₄5.2g/L，柠檬酸钠 10g/L，谷氨酸钠20g/L，玉米浆20mL/L，CaCl₂1g/L，尿素20g/L，MgSO₄·7H₂O5g/L，MnSO₄0.02g/L，ZnSO₄0.02g/L；pH6.7～7.0，115℃，灭菌15min；

另准备1L含80％甘油和6％酵母粉的混合水溶液，和200mL豆粕水解液，豆粕水解 液为市售产品，灭菌条件：115℃，15min，用于发酵过程中流加，灭菌条件：115℃，15min。

(2)培养方法：

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。

种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有100mL种子培养基的1L三角瓶 中，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养6h。

发酵培养：采用分批流加补料工艺，发酵罐初定容3L，接种量为10％，培养温度为 36℃，pH7.0，相对溶氧控制在10-30％，发酵过程中流加甘油酵母粉混合水溶液，甘油的含 量控制在5-15g/L，用0.5M氢氧化钠溶液和豆粕水解液(115℃，15min灭菌处理)调整发酵过 程pH值，发酵周期为60小时。

(3)分析方法：

pH测定：采用pH6.4-8.0精密pH试纸和发酵罐pH电极测定；

生物量测定：发酵过程中，将发酵液适当稀释后用分光光度计测定600nm处的吸光 度值OD600，来表征菌体生长情况；

尿苷含量测定：取离心后的发酵液上清液，用去离子水稀释适当倍数后，用0.22μm 滤膜过滤，采用HPLC法测定发酵液中嘧啶核苷产量。采用的色谱柱为PhenomenexGemini 5uC18110A150*4.6mm，柱温30℃，流动相为2％(v/v)乙腈溶液，流速1mL/min，每个样品 进样10μL，检测器紫外检测器检测，检测波长为270nm。

乙偶姻含量测定：取离心后的发酵液上清液，用去离子水稀释适当倍数后，用0.22 μm滤膜过滤，采用HPLC法测定发酵液中乙偶姻含量。采用的色谱柱为伯乐AminexHPX-87H， 柱温30℃，流动相为5mM硫酸溶液，流速为0.5mL/min，样品进样量为20μL，检测器为示差检 测器。

(4)发酵结果见附图3

发酵结束后，发酵液中的尿苷产量达32g/L，乙偶姻产量达65g/L.

实施例4突变株A260联产尿苷和乙偶姻的发酵工艺

其他条件同实施例3，

发酵培养：采用分批流加补料工艺，发酵罐初定容3L，接种量为15％，培养温度为 34℃，pH7.0，相对溶氧控制在10-30％，发酵过程中流加甘油酵母粉混合水溶液，甘油的含 量控制在5-15g/L，用0.5M氢氧化钠溶液和豆粕水解液(115℃，15min灭菌处理)调整发酵过 程pH值，发酵周期为52小时。

发酵结束后，发酵液中的尿苷产量达27g/L，乙偶姻产量达55g/L。