同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法

摘要

本发明公开一种同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法。该方法利用由4对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对啤酒生产过程快速确定啤酒酵母和发酵过程中是否存在污染酵母菌的检测。本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测4种啤酒污染酵母菌Pichia？fermentans,Candida？mesenterica,Hansenula？polymorpha，Rhodotorula？glutinis，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。

说明书

技术领域

本发明属于啤酒技术领域，涉及一种同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵 母菌的基因快速筛查方法，特别涉及一种基于多重PCR技术以及毛细管电泳 分离技术，用于啤酒酿制中几种污染酵母菌快速筛选的方法。

背景技术

啤酒根据发酵工艺和所用菌种的不同可分为两大类，即爱尔(ale)啤酒 和拉格(lager)啤酒。前者使用酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae) 在相对较高的温度下发酵，酵母菌往往浮在上层，故又称上层发酵啤酒。 后者在低温(10℃左右)条件下发酵，酵母菌往往沉于底层，故又称下层发 酵啤酒。拉格啤酒发酵菌种称为巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。

啤酒酿造是建立在利用啤酒酵母的发酵和控制有害微生物的污染基础 上的。我们需要的是只有酿酒酵母菌参与的纯种发酵，但在整个啤酒酿造 过程中，酿酒酵母菌种的保存、酿造设备、空气、酿造用水等诸多因素都 有可能导致有害微生物进入麦汁或发酵液中。从酿酒过程上游来看，啤酒 酵母的优质和纯度是最为关键的，如果最初用于啤酒发酵的酵母本身含有 污染菌(通常为其他污染酵母菌)，会对整个甚至几个生产批次的啤酒质 量及啤酒整体风味特色，产生严重伤害，例如啤酒酸败、异臭。此外，在 发酵过程中其他污染酵母菌进入麦汁或发酵液，也会污染麦汁和啤酒。污 染酵母菌可以在酿酒环境中和酿酒酵母菌一样，大量繁殖扩增。因此，在 酿造初始，以及在酿造过程中，对酿酒酵母菌的纯度进行监控，显得至关 重要。

污染酵母菌主要有Pichiafermentans,Candidamesenterica, Hansenulapolymorpha，Rhodotorulaglutinis。对于啤酒污染酵母菌的 检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培养法，国内外大多 数啤酒厂采用此类方法，但检测时间长；同时酿酒用酵母菌浓度很高，其 中微量的污染酵母菌通过培养基来培养，经常难以发现，因此无法及时指 导生产技术人员对啤酒生产过程进行监控；第二类是基于PCR技术的分子 生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵 敏度，能够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无 论对于成品啤酒质量的监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的 应用都具有广阔的前景和深远的意义，但一次反应只能检测一类微生物， 并且存在从大量酿酒用酵母菌中检测微量污染酵母菌的敏感度问题。

大量实验已证实，污染酵母菌Pichiafermentans,Candida mesenterica,Hansenulapolymorpha，Rhodotorulaglutinis，鉴别是一 项较复杂的工作，这些污染酵母菌通常以较为微量形式，与高浓度酿酒用 酵母混在一起，检测过程复杂且容易漏检，因而有必要进行更快速更敏感 的检测方法。为了更及时地监控啤酒生产过程的微生物状况，有必要开发 一种针对常见啤酒污染酵母菌速度更快、效果更好的检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，克服常规啤酒中污染酵母菌 Pichiafermentans,Candidamesenterica,Hansenulapolymorpha， Rhodotorulaglutinis检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，提供一种同 时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法，利用由4对引物 组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电 泳分离技术相结合的方式，从而实现对啤酒生产过程快速确定啤酒酵母和 发酵过程中是否存在污染酵母菌的检测。

本发明的技术方案是：

本发明对针4种污染酵母菌对样品进行分析，若能检测出其中任一种污 染菌，则说明样品中含有具有啤酒污染能力的啤酒污染菌。

一种啤酒污染酵母菌的快速筛查方法，采用4重PCR同时扩增4种污染 菌的基因，再通过毛细管电泳分离所述4重PCR扩增产物，所述4重PCR反 应中应用引物SEQIDNO.1～8。

本发明方法具体步骤包括如下：

步骤(1)、啤酒污染酵母菌DNA模板提取：

采用通用的DNA提取方法和纯化方法，从酿酒用高浓度酵母菌中取样 品，或从酿酒过程中麦汁或发酵液中取样品，提取得DNA。

步骤(2)、多重PCR扩增：

将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增,得到扩增产 物；

所述的多重PCR扩增反应体系为20ul由100nM正向混合引物2ul，100nM 反向混合引物2ul，25mM的MgCl₂4ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚 合酶0.7ul，DNA模板1ul和余量双蒸水；其中正向混合引物中SEQIDNO.1 引物、SEQIDNO.3引物、SEQIDNO.5、SEQIDNO.7引物的浓度比为1:1:1:1， 反向混合引物中SEQIDNO.2引物、SEQIDNO.4引物、SEQIDNO.6、SEQ IDNO.8引物的浓度比为1:1:1:1；

所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s； 58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；

表1本发明设计的用于污染酵母菌的基因检测的4重引物体系各引物序列

步骤(3)、毛细管电泳分离条件：

分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95％去 离子甲酰胺38.5ul，400bpDNAMarker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、 6.0KV电压下，分离35min；

步骤(4)、检测鉴定：

将所述步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多 重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因 片段长度为142bp、147bp、335bp、359bp相应位置处出现特征峰；若在142bp 相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Pichia fermentans；若在147bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含 有污染酵母菌Candidamesenterica；若在335bp相应位置处出现特征峰， 则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Hansenulapolymorpha；若在359bp 相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有污染酵母菌 Rhodotorulaglutinis。

表2四种污染酵母菌

与现有技术相比本发明具有如下特点：

其一，本发明可在同一PCR管中进行，操作简单，能快速确定是否存 在啤酒污染酵母菌，且检测结果准确；

其二，通过分析基因确定啤酒污染酵母菌Pichiaermentans,Candida mesenterica,Hansenulapolymorpha，Rhodotorulaglutinis在啤酒酿造 初始和过程中的微量存在，及时发现啤酒中有害酵母菌，实现有效的监测 及预防作用；

其三，本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手 段，能够在一次反应中集成检测4种啤酒污染酵母菌，节约了检测成本，节 省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。

附图说明

图1为本发明具体实施例1的多重PCR-毛细管电泳谱图；

图2为本发明具体实施例2的多重PCR-毛细管电泳谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

实施例1：

(1)啤酒污染酵母菌的培养及DNA模板提取：

挑取平板培养基上长出的啤酒污染酵母菌Pichiaermentans,Candida mesenterica,Hansenulapolymorpha，Rhodotorulaglutinis单菌落， 按照Qiagen公司的GenomicDNAPurificationKit试剂盒的使用说明提取 啤酒污染酵母菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下 测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。

(2)四重PCR扩增

所用引物体系为表1所述的SEQIDNO.1-8，20ulPCR反应体系：100nM 正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl₂4ul， 5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水 使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min 为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；

(3)毛细管电泳分离条件

分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与95％去离子甲酰胺 38.5ul，400bpDNAMarker0.5ul混合均匀；

分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；

(4)数据分析

使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXPGeneticAnalysisSystem分析系 统自动对分离结果进行分析，结果图1所示，4种污染酵母菌的基因均被检 出，使用本发明在一次反应，能够捕捉到样品中4种污染酵母菌基因的特 征峰。

实施例2：

啤酒的两大类，即爱尔(ale)啤酒和拉格(lager)啤酒，前者使用酿酒 酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，拉格啤酒发酵菌种为巴斯德酵母 (Saccharomycespastorianus)，在酿酒过程的上游，以高浓度存在。本 实例可以证明本发明对污染酵母菌Pichiafermentans,Candida mesenterica,Hansenulapolymorpha，Rhodotorulaglutinis的检测特异 性，即本发明的检测方法在仅酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)存 在或巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)存在情况下，未显示特征 峰，2种非污染常用酵母菌(Saccharomycescerevisiae和Saccharomyces pastorianus)存在不会对检测产生干扰。

本发明的操作步骤如实施例1所述。

(1)啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：

挑取平板培养基上长出的酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)存 在和巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)单菌落，按照Qiagen公司 的GenomicDNAPurificationKit试剂盒的使用说明提取酿酒酵母菌和巴 斯德酵母的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提 取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。

(2)四重PCR扩增

所用引物体系为表1所述的SEQIDNO.1-8，20ulPCR反应体系：100nM 正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl₂4ul， 5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水 使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min 为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；

(3)毛细管电泳分离条件

分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与95％去离子甲酰胺 38.5ul，400bpDNAMarker0.5ul混合均匀；

分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；

(4)数据分析

使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXPGeneticAnalysisSystem分析系 统自动对分离结果进行分析，结果显示，没有特征峰出现，即酿酒酵母菌 (Saccharomycescerevisiae)或巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus) 的存在对检测结果没有影响，不会出现假阳性结果。

实施例3：

在酿酒过程的中，非污染发酵酵母菌(Saccharomycescerevisiae和 Saccharomycespastorianus)发酵菌种以高浓度存在，污染酵母菌Pichia fermentans,Candidamesenterica,Hansenulapolymorpha，Rhodotorula glutinis以低浓度存在。本实例可以证明本发明对微量的污染酵母菌和高 浓度发酵菌种共存时，本发明对检测微量污染酵母菌的敏感性。

本实例采用啤酒酿造的2种非污染常用酵母菌(Saccharomyces cerevisiae和Saccharomycespastorianus)，以10万倍：1的浓度比和污染 酵母菌混合成样品，以检测本发明的灵敏性。

分别挑取平板培养基上长出的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，和巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)单菌落加入 100mL培养基中，在有氧环境中培养至制成菌悬液，分光光度OD＝0.2左右。 污染酵母菌Pichiafermentans,Candidamesenterica,Hansenula polymorpha，Rhodotorulaglutinis单菌落加入5mL培养基中，在有氧环 境中培养至制成菌悬液，分光光度OD＝0.2左右。根据OD值计算菌悬液浓度， 以10万倍：1的浓度，将酿酒酵母菌或巴斯德酵母，和污染酵母菌混匀。取 1mL该菌悬液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀， 移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml 溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。

之后按照Qiagen公司的GenomicDNAPurificationKit试剂盒的使用 说明提取DNA模板，多重PCR反应体系使用Thermo-DNAPolymeraseDNA 试剂盒，使用4重PCR反应体系，所用引物体系为表1所述的SEQIDNO.1-8， 20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul， 25mM的MgCl24ul，5×PCR缓冲液4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模 板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃30s； 58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温； 毛细管电泳分离条件：采用分离体系：1ul上述多重PCR扩增产物与95％去 离子甲酰胺38.5ul，400bpDNAMarker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、 6.0KV电压下，分离35min，使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXPGenetic AnalysisSystem分析系统自动对分离结果进行分析，得到多重PCR-毛细管 电泳谱图，在与10万倍浓度的酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)， 或巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)共存情况下，能够检测出污 染酵母菌Pichiafermentans,Candidamesenterica,Hansenula polymorpha，Rhodotorulaglutinis基因的特征峰，结果显示，10万倍浓 度的酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)与Pichiafermentans混合， 能够检测Pichiafermentans的基因特征峰，所示说明样品中含有大量非污 染酵母菌，对检测污染酵母菌的灵敏度未造成干扰，并显示了高灵敏性。

序列表

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例， 只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCELISTING

<110>杭州电子科技大学

<120>同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法

<130>1

<160>8

<170>PatentInversion3.3

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<211>37

<212>DNA

<213>人工合成

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