啤酒中污染菌的分离纯化、快速检测与鉴定

摘要

啤酒中污染菌是啤酒生产中不可避免的一种生物污染。准确、快速地检测和鉴定出啤酒中的污染菌不仅能保证啤酒品质，还体现出啤酒企业所具有的高技术水平。随着现代生物技术的发展，污染菌的检测方法也日新月异，现在已经成熟应用的有选择性培养基和5种检测和鉴定方法，它们分别是ATP法、抗原抗体免疫法、PCR扩增法、原位杂交法和D-乳酸脱氢酶的电泳谱图法。 本研究的主要内容是使用选择性培养基分离纯化出10种污染菌，根据细菌形态把它们分别编号为Ls、Lm、Ll、Lsuper、Lw、P、4-1、5221、5222、928，利用API50CHL鉴定试剂条把它们分别定义为植物乳杆菌、乳酸菌乳球菌乳亚种、短乳杆菌3、短乳杆菌3、短乳杆菌1、短乳杆菌1、植物乳杆菌2、布氏乳杆菌、食果糖乳杆菌、德氏乳杆菌德亚种、不可判定菌种。 为了更准确地鉴定上述细菌，本研究使用了参考引物“27F-907R”作为测序引物，经过实验证明该引物所产生的PCR扩增结果条带单一、清晰明亮。经过测序和网上BLAST软件比对确定Ls属于Lactobacillusplantarum，4-1和5221属于Lactobacillus parabuchneri，Lm、Lw、P和5222属于Lactobacillus perolens，928属于C.berincldi，Ll的比对结果则是属于“Unculmred bacterium clone rRNA228 16S ribosomal RNAgene”即不能确定具体的种。但是根据API50CHL的鉴定结果和参考的与自己设计的短乳杆菌特异性引物经过PCR鉴定为短乳杆菌，故确定Ll为Lactobacillus brevis。根据测序的结果设计出三套种鉴定引物，他们分别是Lactobacillusbrevis、Lactobacillu parabuchneri和Lactobacillus perolens鉴定引物，然后通过条件优化确定最佳的退火温度和退火时间，它们分别为45℃1min、55℃2min和56℃2min。外加参考的Lactobacillus brevis和Lactobacillus plantarum种特异性引物组成一个种鉴定引物系列。 对经过鉴定的污染菌进行抗啤酒花性和啤酒污染性鉴定，经过实验确定Ls、Lm、Ll、LW、P、4-1、5221、5222、928最大的抗啤酒花浓度依次为Ll>928>Lw>5221>Lm、4-1>Ls、P>5222，同时啤酒污染能力的大小顺序依次为L1、Lw>5221>P>Ls、Lm>5222>4-1。用啤酒花对污染菌进行驯化，最大的驯化浓度大小依次为Ll、LW>P>Lm>5221、928>4-1、Ls>5222，显然经过驯化后抗啤酒花能力出现了比较大的变化，特别是Lw、P的抗啤酒花性有很大的提高。通过对抗啤酒花基因horA、horB和horC扩增确定了抗啤酒花基因的拷贝数多少依次为Ll、LW、P、5221>4-1、Ls>5222、Lm，这与最大驯化浓度大小顺序和啤酒污染浓度大小顺序相吻合。最后通过实验确定啤酒花的驯化浓度和horA的拷贝数呈正相关。最后确定horA改良引物的最低检测浓度为21个/mL。

目录

文摘

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声明

第一章 综述

1.1啤酒工业的现状

1.2啤酒污染菌污染啤酒的原理

1.3检测与鉴定方法的研究进展

1.3.1常规的检测控制方法

1.3.2 ATP法

1.3.3抗原抗体免疫法

1.3.4 PCR扩增法

1.3.5原位杂交法

1.4本课题的立足点和拟解决的问题

第二章啤酒中污染菌的分离、纯化

2.1引言

2.2实验材料和设备

2.2.1实验材料

2.2.2培养基和试剂

2.2.3仪器设备

2.3实验方法

2.3.1过氧化氢酶反应试验

2.3.2氢氧化钾试验

2.3.3细菌的富集

2.3.4结合稀释涂布平板法和选择性培养基分离和纯化细菌

2.3.5 API50CHL菌种鉴定

2.4结果与讨论

2.4.1结果

2.4.2讨论

第三章啤酒中纯化的污染菌序列测定及其分析

3.1引言

3.2实验材料和设备

3.2.1培养基和试剂

3.2.2仪器设备

3.3实验方法

3.3.1引物的配制

3.3.2提取和纯化染色体DNA

3.3.3 PCR扩增

3.3.4 1.5％的琼脂凝胶电泳

3.3.5测序

3.4结果与讨论

3.4.1扩增结果

3.4.2拼接

3.4.3测序结果

3.4.4同源性比较

3.4.5BLAST比对的结果

第四章种特异性鉴定引物的设计

4.1引言

4.2实验材料和设备

4.2.1培养基和试剂

4.2.2仪器设备

4.3实验方法

4.3.1引物的设计

4.3.2引物的配制

4.3.3提取和纯化染色体DNA

4.3.4 PCR扩增

4.3.5 1.5％的琼脂凝胶电泳

4.4结果与讨论

4.4.1两种短乳杆菌的鉴定引物的PCR扩增产物电泳图谱

4.4.2植物乳杆菌的鉴定引物的PCR扩增产物电泳图谱

4.4.3 L.parabuchneri的鉴定引物的条件优化

4.4.4 L.perolens的鉴定引物的条件优化

第五章啤酒中污染菌的抗啤酒花性能的研究

5.1前言

5.2实验材料和设备

5.2.1培养基和试剂

5.2.2仪器设备

5.3实验方法

5.3.1细菌抗啤酒花研究

5.3.2抗啤酒花基因跨种标记的研究

5.3.3编号为L1的细菌关于horA，horB,horC灵敏度实验

5.3.4啤酒花的驯化对抗啤酒花基因的影响

5.4结果与讨论

5.4.1污染菌最大的抗啤酒花浓度

5.4.2污染菌的最大驯化浓度

5.4.3污染菌的污染啤酒的能力

5.4.4 horA、改良horA、horB、horC扩增

5.4.5采用的是编号为L1的细菌关于horA、horB、horC灵敏度实验

5.4.6污染菌的驯化浓度与抗啤酒花基因标记horA、horB和horC的关系

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表的学术论文