一种含耐热保护剂的直投式发酵剂的生产方法

摘要

本发明属于微生物技术领域，涉及一种微生物发酵制剂，具体涉及一种含有耐热保护剂的用于乳制品的固体直投式发酵剂。为了解决现有发酵剂存在活性低、保质期短的问题，本发明提供了一种含耐热保护剂的直投式发酵剂的生产方法，该方法包括菌种的培养、分离、冻干提纯，并且在冻干提纯与分离过程之间加入了保护剂，从而尽量减少发酵菌种的死亡或者失活，使得制得的发酵剂产品的保存期由常规的4～6个月延长到12个月，并且制得的发酵剂在保存12个月后还能保持其生物活性，使牛奶成功地发酵为酸奶。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种制备微生物发酵制剂的方法，具体涉及一种含有耐热保护剂的用于乳制品的固体直投式发酵剂的方法。

背景技术

乳品和发酵乳是非常优秀的食品，它们因含有丰富的营养成分而备受消费者喜爱。尤其是发酵乳制品，如牛奶经过发酵后的酸奶营养价值更高，更易被消化和吸收。并且已经证明，酸奶具有降低胆固醇、预防动脉硬化、促进消化吸收、防止骨质疏松等功能。其中的乳酸菌可以分解乳糖，减少乳糖不耐症的发生，还可以减少人体内的腐败菌生长，有增强人体免疫和抗癌功能。这几年保持着连续增长的好势头。

酸奶的制造需要乳酸菌发酵剂，传统发酵剂制造酸奶的工序繁杂、并且容易被污染，难保证发酵剂质量的稳定，因而也难保证最终发酵制品的质量。目前虽然有单位对其进行研究和获得进展，但是很多发酵剂还存在着活性低、保质期短和保存条件要求高的特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于现有发酵剂存在活性低、保质期短的问题，并针对该问题提供一种含耐热保护剂的直投式发酵剂的生产方法。

本发明通过下列技术方案解决上述技术问题：

一种含耐热保护剂的直投式发酵剂的生产方法，包括：

a、培养液的配置

所述培养液包括：

水解蛋白胨、酵母膏或酵母粉、小牛膏粉、葡萄糖、乳糖、无水乙酸钠、吐温80、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二氨、以及软化饮用水；

b、对培养液进行灭菌并降温，得到培养基，随后将菌种接入培养基进行培养；

c、收集经b步骤所述培养基培养后的菌体，得到菌泥；

d、将c步骤得到的菌泥与保护剂混合，得到混合物，在所述混合物上加入水，得到冻干液，所述保护剂包括：脱脂乳粉、蔗糖或乳糖、海藻糖、吐温80、酵母膏、血清、维生素E、精氨酸、PVP、水、磷酸盐pH调节液适当；

e、对d步骤得到的冻干液进行预冻处理，得到预冻物，随后对预冻物进行真空冷冻干燥，解除真空得到的冻干物即得到含耐热保护剂的直投式发酵剂。

得到的直投式发酵剂含水量为2～5％，使用时它的接种量为0.01～0.02％。

发酵剂的制备大致需要经历菌种培养、分离提纯等环节，为了提高发酵剂的生物活性及保存期限，可以对这两个环节进行优化，从而减少发酵菌种在发酵剂的制备过程中的死亡或失活现象的发生。

本发明所关注的重点是在分离提纯环节尽量减少发酵菌种的死亡或者失活，采用的技术手段是在制备发酵剂过程中的冻干步骤前加入具有特殊配方的保护剂，这种技术手段的应用能使发酵剂产品的保存期由常规的4～6个月延长到12个月，并且通过该技术手段制得的发酵剂在12个月后还能保持其生物活性，使牛奶成功地发酵为酸奶。

本发明所述的保护剂是由各种有效成分组成的统一体，其整体效能离不开各有效成分的有益作用：

维生素E能够通过自身氧化消耗冻干样品内部和环境中的氧，并且放入电子或氢离子，可阻断冻干液或发酵剂的氧化链式反应，抑制氧化酶活性，防止得到的直投式发酵剂在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质；

海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯酮(PVP)等作为主要的耐热冻干保护剂，以这三种物质复配的耐热冻干保护剂主体在冻结和干燥过程中，可防止活性菌粉变性，减少外界不良环境对菌体的影响。

同时海藻糖(TRH)还能够使冻干液在冻干过程中形成一种玻璃态(即TRH水溶液干燥时黏度随浓度的增加而增大，当达到一定浓度且糖未结晶时，其水溶液就会玻璃化，这种状态称为玻璃态)。

当冻干液干燥时，TRH紧密地包住相邻的分子，形成一种在结构上与玻璃状的冰相类似的碳水化合物玻璃体，其扩散系数很低，分子运动和分子变性非常微弱，能够使生物分子维持一定的空间结构。

海藻糖的高效生物保护作用与它的玻璃态形成有关，因此加入海藻糖能对冻干液产生很好的保护作用，蔗糖同样具有类似的作用。

聚乙烯吡咯酮(PVP)的另一种作用是：在低血清浓度下对细胞的生长有促进作用，可用作固体分散体载体，其良好的成膜性、粘接能力等可以作为抑晶剂来防止冻干过程中物质浓度的增加而发生结晶作用，减少对细胞的伤害。

脱脂奶粉与精氨酸具有在保证菌种不被真空抽走的情况下，加快冻干液的升华速度的作用，一方面，精氨酸具有一定的黏结作用，可防止菌粉随水蒸气一起升华飞散，被真空抽走；另一方面，脱脂奶粉能够加快冻干液的升华速度。

而蛋白质是一种两性电解质，既能和酸作用又能和碱作用。在中性环境中，大多数蛋白质是稳定的，由于冻干液在冻结过程中蛋白质的浓度是逐渐升高的，所以在高浓度时蛋白质可改变溶液的pH值，pH缓冲也可防止蛋白质变性，生物制品失活。

另外，酵母膏、血清、蔗糖或乳糖、精氨酸、脱脂乳粉同时还是菌株存活的良好营养物质。

为了使各组分的有益效果能够最大程度的发挥，需要对保护剂的各组分之间的配比进行合理的设计，本发明所提到的100g保护剂可以这样进行调配：脱脂乳粉50g、蔗糖或乳糖15-24g、海藻糖2.5-7.5g、吐温800.25-0.75g、酵母膏2.5-7.5g、血清2.5-7.5g、维生素E 0.25-0.75g、精氨酸5-10g、PVP 10-25g。在此基础上再加水适量、磷酸盐(钾盐或钠盐)pH调节液适量。

同时，为了使保护剂的整体技术效果能够充分发挥，还需要调整菌泥与保护剂之间的投料比，比较合理的一种投料比是菌泥与保护剂按照重量比为1∶1-2的比例投料，技术人员可以选择性的使用本发明按照上面提供的配比配制出的保护剂与菌泥混合，从而达到更好的技术效果。

本发明所讲到的制备直投式发酵剂的方法所采用的菌种可以是发酵技术领域能够被用于制备发酵剂的各种菌种，针对各种菌种的生物特性，技术人员可以调节本发明方法中培养液各种成分的配比，培养温度等参数，为菌种繁殖生长提供与之相匹配的环境，而在后续步骤中使用本发明的保护剂，均能够使制备的各种菌种的保存期限延长，从而实现本发明的发明目的。

具体实施方式

本实施方式所采用的菌种为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，各物料配比未经特别说明的，各种百分数均指质量百分数：

1、培养液的配置

所述培养液包括：

0.5-2％的水解蛋白胨、

0.5-2％的酵母膏或0.4-0.8％的酵母粉、

0.6-1.2％的小牛膏粉、

0.8-2％的葡萄糖、

0-2％的乳糖、

0.2-0.6％的无水乙酸钠、

0.05-0.015％的吐温80、

0.1-0.3％的磷酸氢二钾、

0.1-0.3％的柠檬酸氢二氨以及软化饮用水，配置好的培养液的pH值为6.8-7.2；

2、对培养液进行灭菌并降温到37-43℃，得到培养基，并向培养基加入具有缓冲作用并能够减缓发酵过程pH值的快速降低的超细碳酸钙，使得超细碳酸钙在培养基中的质量百分比为0.05％-0.1％，随后将菌种接入培养基，在40±2℃条件下培养6-12小时，在培养过程中，用10-20％氢氧化钠保持培养液的pH值在5.6-6.2之间，培养结束后，用氢氧化钠调控培养液pH值在6.0-6.5之间，然后将培养液的温度降至4-20℃之间，经检测，培养基内的活菌数大于10⁹/ml；

3、收集2步骤得到培养液中的菌体，得到菌泥，收集菌体可以采用离心浓缩或膜过滤器浓缩的方式进行；

4、将3步骤得到的菌泥与保护剂按照重量比为1∶1-2的比例混合，得到混合物，在所述混合物上加入水，得到混合物的质量百分比为6-20％的冻干液，混合物的质量百分比维持在这一范围是较为合理的，混合物的质量百分比太低会导致抽真空时，混合物被水蒸气带走，太高不利于热传递和疏松状态的发酵剂产品的形成，本实施方式建议冻干液中混合物的质量百分比最好为10～15％。

所述100g保护剂包括：脱脂乳粉50g、蔗糖或乳糖15-24g、海藻糖2.5-7.5g、吐温800.25-0.75g、酵母膏2.5-7.5g、血清2.5-7.5g、维生素E 0.25-0.75g、精氨酸5-10g、PVP 10-25g、水、磷酸盐pH调节液适当。

5、在-18℃～-40℃条件下，对4步骤得到的冻干液进行预冻处理，得到预冻物，随后对预冻物进行真空冷冻干燥，干燥过程中，首先将物料温度降到-30℃以下，冷阱温度低于-45℃，再抽真空干燥，使真空冷冻干燥腔的真空度为5-30Pa，冻干结束时真空度≤3Pa，用洁净氮气解除真空，取出冻干物即得到含耐热保护剂的直投式发酵剂。

本实施方式可以向5步骤得到的含耐热保护剂的直投式发酵剂加入双歧杆菌、嗜酸乳杆菌以及干酪乳杆菌，所述双歧杆菌的加入量为10⁸-10¹⁰CFU/g，嗜酸乳杆菌的加入量为10⁸-10¹⁰CFU/g，干酪乳杆菌的加入量为10⁸-10¹¹CFU/g。

本实施方式还可以在1步骤中的培养液中进一步的加入蜂蜜、酶解大豆肽、及胡萝卜汁，添加后，蜂蜜在培养液中的质量百分比为0.3-1.2％，酶解大豆肽在培养液中的质量百分比为0.5-3％，胡萝卜汁在培养液中的质量百分比为0.5-2％。

也可以在2步骤对菌种的培养过程中向培养基加入蜂蜜、酶解大豆肽、及胡萝卜汁。添加后，蜂蜜在培养基中的质量百分比为0.3-1.2％，酶解大豆肽在培养基中的质量百分比为0.5-3％，胡萝卜汁在培养基中的质量百分比为0.5-2％。

在培养基的配制过程或发酵培养过程中，增加或流加蜂蜜、酶解大豆肽、胡萝卜汁可以促进菌体增殖。

实验证明，含耐热保护剂的直投式发酵剂在2℃-8℃条件下，保存12个月后，发酵仍能成功。

实施例1

①、培养基的配制：采用改良的MRS培养基，水解蛋白胨1％、酵母膏1％、小牛膏粉1％、葡萄糖1％、乳糖1％、无水乙酸钠0.5％、吐温800.1％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸氢二氨0.2％，蜂蜜0.5％，胡萝卜汁0.1％，其余为软化饮用水，并使pH值控制在7.2；

②、培养基经灭菌并降温到37～43℃后，接入事先准备好的菌种，接种量为2％，在41℃恒温条件下培养10.5小时。培养过程中采用20％氢氧化钠来控制培养液的pH值，控制在5.6～6.2之间。在培养5小时后开始流加胡萝卜汁(流加4小时，共计发酵体积的0.2％)。培养结束后将pH值调整为6.3。然后将培养液降温到18℃。取样检测活菌数为1.6×10⁹/ml；

③、将上述培养液中的菌体收集获得菌泥。采用离心浓缩获得菌泥。采用蝶片式离心机，在最大分离因素为10300的条件下获得菌泥；

④、经秤量获得菌泥为2.6Kg，加入保护剂共4.72Kg(其中配方为脱脂乳粉2000g、蔗糖或乳糖1200g、海藻糖100g、吐温8010g、酵母膏300g、血清100g、维生素E 10g、精氨酸200g，PVP 800g，水约15.28kg)，菌泥中的含水量约为75％，另加水18kg，混合均匀，得40.4Kg冻干液；

⑤、对冻干液进行冻干，获得5.30kg固体产品，经检测其含水量为3.62％。

该产品在2～8℃条件下，保存12个月后，向牛奶接种0.01％的条件下，43℃恒温发酵5小时，开始出现凝乳现象，证明发酵仍能成功。

实施例2

(1)、培养基的配制：采用改良的MRS培养基，水解蛋白胨1％、酵母膏1％、小牛膏粉1％、葡萄糖1％、乳糖1％、无水乙酸钠0.5％、吐温800.1％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸氢二氨0.2％，大豆肽0.5％，蜂蜜0.2％，0.05％的碳酸钙，其余为软化饮用水，并使pH值控制在7.2；

(2)、培养基经灭菌并降温到37～43℃后，接入事先准备好的菌种，接种量为2％，在41℃恒温条件下培养10小时。培养过程中采用氢氧化钠来控制培养液的pH值，控制在5.6～6.2之间。培养结束后将pH值调整为在6.3。然后将培养液将温到18℃。取样检测活菌数为1.3×10⁹/ml；

(3)、将上述培养液中的菌体收集获得菌泥，采用离心浓缩获得菌泥。采用蝶片式离心机，在最大分离因素为10300的条件下获得菌泥；

(4)、经秤量获得菌泥为2.4Kg，加入保护剂共4.72Kg(其中组方为脱脂乳粉2000g、蔗糖或乳糖1200g、海藻糖100g、吐温8010g、酵母膏300g、血清100g、维生素E10g、精氨酸200g，PVP 800g，水约15.28kg)，菌泥中的含水量约为75％，另加水18kg，混合均匀，得40.4Kg冻干液；

(5)、对冻干液进行冻干，获得5.30kg固体产品，经检测其含水量为3.62％。

该产品在2～8℃条件下，保存12个月后，向牛奶接种0.01％的条件下，43℃恒温发酵5小时，开始出现凝乳现象，证明发酵仍能成功。

实施例3

I、培养基的配制：采用改良的MRS培养基，水解蛋白胨1％、酵母膏1％、小牛膏粉1％、葡萄糖1％、乳糖1％、无水乙酸钠0.5％、吐温800.1％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸氢二氨0.2％，大豆肽0.5％，胡萝卜汁0.2％，其余为软化饮用水，投料在1吨发酵罐内，并使pH值调整到7.2；

II、培养基经灭菌并降温到37～43℃后，接入事先准备好的菌种，接种量为2％，在41℃恒温条件下培养10小时。培养过程中采用氢氧化钠来控制培养液的pH值，控制在5.6～6.2之间。培养结束后将pH值调整为在6.3，然后将培养液将温到18℃，取样检测活菌数为1.26×10⁹/ml；

III、将上述培养液中的菌体收集获得菌泥，采用膜浓缩获得菌泥，发酵液浓缩约11倍，得浓缩液；

IV、经秤量获得浓缩液为65Kg，加入保护剂共4.72Kg(其中配方为脱脂乳粉2000g、蔗糖或乳糖1200g、海藻糖100g、吐温80 10g、酵母膏300g、血清100g、维生素E10g、精氨酸200g，PVP 800g、其余为水)，得到冻干液；

V、对冻干液进行冻干，获得5.32kg固体产品，经检测其含水量为3.6％。

上述产品在2～8℃条件下，保存12个月后，向牛奶接种0.015％的条件下。43℃恒温发酵4.7小时，开始出现凝乳现象，证明发酵仍能成功。