连续酶解与超滤分离偶联制备麦胚蛋白ACE抑制肽的方法

摘要

连续酶解与超滤分离偶联法制备小麦胚芽蛋白血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的方法，该方法按照下述步骤进行：将脱脂小麦胚芽粉进行粉碎，用中温淀粉酶法提取麦胚蛋白；对麦胚蛋白溶液进行均质后采用蛋白连续酶解与超滤分离偶联的技术进行麦胚降血压肽的制备与分离，最后通过浓缩与干燥得到粉状的麦胚降血压肽产品。该方法可以使产物不断在线分离避免其过度酶解，同时酶得到循环利用，提高了单位酶的利用率；此外，避免了间歇操作中的灭酶操作，实现了制备麦胚蛋白ACE抑制肽工艺的连续性。通过该方法制备得到麦胚蛋白ACE抑制肽可用于制备具有抑制体内血管紧张转换酶ACE的活性的药物或保健食品。

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体涉及功能食品生产技术和生物制药领域，特指连续酶解与超滤分离偶联术制备小麦胚芽蛋白ACE抑制肽方法。

背景技术：

血管紧张素转化酶(ACE)对机体血压和心血管功能起着重要的调节作用。ACE抑制剂通过抑制ACE从而阻止血管紧张素I转化为具有强烈收缩血管作用的血管紧张素II，同时阻止ACE对具有舒张血管作用舒缓激肽的降解，从而达到降血压的目的。

小麦胚芽是面粉加工中的主要副产物，也是小麦中营养最丰富的部分，其含量在小麦籽粒中约为2％-3％，其中含有极其丰富的优质蛋白质、脂肪、维生素、淀粉等物质。目前从小麦胚芽中提取小麦胚芽油已经商业化生产，并得到消费者的青睐。脱脂后的小麦胚芽粕蛋白质含量约为30％左右，其氨基酸组成合理，具有较高的营养价值。目前麦胚蛋白主要用做功能性配料。小麦胚芽蛋白中疏水性氨基酸的含量高，占总氨基酸的47％左右，根据ACE抑制肽定量构效模型(QSAR)表明，末端疏水性氨基酸是高活性ACE抑制肽的一个重要的组成条件，因此麦胚蛋白是开发ACE抑制肽良好的蛋白资源。

目前国内外对麦胚蛋白ACE抑制肽的研究报道有：1999年日本的Toshiro Matsui等人酶解麦胚蛋白得到16种ACE抑制肽，它们对原发性高血压大鼠(SHR)有降血压效果；2003年我国辛志宏等研究发现3,000 Dalton以下的脱脂麦胚蛋白酶解物对SHR有良好降压作用。以上报道表明麦胚ACE抑制肽产品具有降血压功能，对其开发生产很有前景。

但是现有的麦胚ACE抑制肽的研究工作主要是通过间歇酶解法，然后进行下游分离，间歇酶解法存在着以下一些重要缺陷：酶解效率低下、单位酶资源利用率低；产物过度降解，降低了产物活性；工艺不连续和纯化方法繁琐。这些问题严重制约了该产品的生产和市场化进程。

发明内容：

本发明的目的是用连续酶解与超滤分离偶联技术制备小麦胚芽蛋白ACE抑制肽及用途。

本发明上述目的是通过以下技术手段来实现：脱脂小麦胚芽粉进行粉碎、用中温淀粉酶法提取麦胚蛋白。对麦胚蛋白溶液进行均质，再对麦胚蛋白溶液采用蛋白连续酶解与超滤分离偶联的技术进行麦胚降血压肽的制备与分离，最后通过浓缩与干燥得到粉状的麦胚降血压肽产品。

将脱脂小麦胚芽粉按照8％-12％的浓度溶于水，在pH值8-9.5下搅拌0.5h-1h，离心获得上清液调节pH值到6.0-7.5采用中温淀粉酶在60℃-70℃下酶解120-240min，加酶量为1％-2.5％(w/v)；酶法降解淀粉后，调节pH到4-4.5，得到沉淀，用水溶解稀释，调节pH值至中性，喷雾干燥或冷冻干燥。将提取的小麦胚芽胚芽蛋白配置成底物浓度为1％-3％的溶液，用均质机进行均质，随后进行酶膜耦合水解，采用加酶量为麦胚蛋白重量的2％-8％(w/w)，pH为6-9，温度37℃-50℃。酶解反应液送入到超滤装置，产物溶液透过超滤膜，没有反应的底物和酶溶液继续回到反应器中反应，超滤膜的截留分子量为1-5kDa，超滤压力维持在0.3-1.5kg/cm²，出肽速率为5-12ml/min。同时根据透过产物的量，补充麦胚溶液进入反应釜，根据反应釜中pH的变化，通过自动装置动态进行pH的调节，维持在所需的pH值附近。透过液用真空浓缩装置浓缩至固形物含量30％左右，用喷雾干燥进行干燥，得到粉状的麦胚ACE抑制肽产品。

本发明所具有的优点是：采用连续酶解与超滤分离偶联技术，将产物不断在线分离避免其过度酶解，同时酶得到循环利用，提高了单位酶的利用率。此外，避免了间歇操作中的灭酶操作，实现了制备麦胚蛋白ACE抑制肽工艺的连续性。

附图说明

图1是本发明利用连续酶解与超滤分离偶联技术制备小麦胚芽蛋白ACE抑制肽的方法的工艺流程；

图2本发明连续酶解与超滤分离偶联技术制备小麦胚芽蛋白ACE抑制肽的采用的装置：1-加碱器；2-补料泵；3-原料釜；4-恒温水浴锅；5-酶解反应器；6-恒温水浴槽；7-循环泵；8-出肽阀门；9-超滤膜组件；10-机密酸度计。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1

将脱脂小麦胚芽粉按照10％(w/v)的浓度加入水中，在pH值9.5下搅拌0.5h，离心获得上清液调节pH值到7.0，采用中温淀粉酶在70℃下酶解180min，加酶量为3％(w/v)；酶法降解淀粉后，调节pH到4.5，得到沉淀，用水溶解稀释，调节pH值至中性，喷雾干燥。

称取5kg麦胚蛋白，加入50倍重量的去离子水，搅拌溶解，配置成2％的溶液，均质后加入麦胚蛋白质量的8％(w/w)的碱性蛋白酶，维持反应液pH值为9.0，在40℃进行酶解反应。酶解反应液送入到超滤装置，产物溶液透过超滤膜，没有反应的底物和酶溶液继续回到反应器中反应，超滤膜的截留分子量为5kDa，超滤压力维持在1.2kg/cm2，出肽速率为12ml/min。同时根据透过产物的量，补充相同浓度麦胚溶液进入反应釜，根据反应釜中pH的变化，通过自动装置动态进行pH的调节，维持在pH9.0。透过液用真空浓缩装置浓缩至固形物含量30％左右，用喷雾干燥进行干燥，得到粉状的麦胚ACE抑制肽产品，用高效液相色谱法测定ACE的IC₅₀值(使测定时的ACE50％的活性受到抑制所需要的ACE抑制肽浓度，ACE抑制肽的IC₅₀值越低，其对ACE的抑制效果越高)，即分别用0.1mol/L pH8.3硼酸缓冲液(含0.3mol/L NaCl)配置稀释成不同浓度样品与三肽(马尿酸-组氨酸-亮氨酸)反应30min，以高效液相色谱测定反应各自生成的马尿酸的量，计算不同浓度ACE抑制肽对ACE的抑制率，根据抑制肽的浓度与相应的抑制率回归模型，求出抑制率达50％时的ACE抑制浓度。经测定此实例ACE的IC₅₀值为0.875mg/mL。

实施例2

将脱脂小麦胚芽粉8％(w/v)的浓度加入水中，在pH值8.5下搅拌0.5h，离心获得上清液调节pH值到6.5，采用中温淀粉酶在60℃下酶解240min，加酶量为1％(w/v)；酶法降解淀粉后，调节pH到4，得到沉淀，用水溶解稀释，调节pH值至中性，喷雾干燥。

称取5kg麦胚蛋白，加入100倍重量的去离子水，搅拌溶解，配置成1％的麦胚溶液，均质后加入碱性蛋白酶，加酶量为麦胚蛋白质量的6％(w/w)，维持反应液pH值为8.0，在50℃进行酶膜耦合反应。酶解反应液送入到超滤装置，产物溶液透过超滤膜，没有反应的底物和酶溶液继续回到反应器中反应，超滤膜的截留分子量为3kDa，超滤压力维持在0.3kg/cm²，出肽速率为6ml/min。同时根据透过产物的量，补充相同浓度麦胚溶液进入反应釜，根据反应釜中pH的变化，通过自动装置动态进行pH的调节，维持在所需的pH值附近。透过液用真空浓缩装置浓缩至固形物含量30％左右，用喷雾干燥进行干燥，得到粉状的麦胚ACE抑制肽产品，经测定其对ACE的IC₅₀值为0.778mg/mL。

实施例3

将脱脂小麦胚芽粉12％(w/v)的浓度加入水中，在pH值9.5下搅拌0.5h，离心获得上清液调节pH值到7.5，采用中温淀粉酶在70℃下酶解120min，加酶量为2.5％(w/v)；酶法降解淀粉后，调节pH到4，得到沉淀，用水溶解稀释，调节pH值至中性，喷雾干燥。

称取5kg麦胚蛋白，加入100倍重量的去离子水，搅拌溶解，配置成1％的麦胚溶液，均质后加入中性蛋白酶，加酶量为麦胚蛋白质量的4％，维持反应液pH值为7.0，在45℃进行酶膜耦合反应。酶解反应液送入到超滤装置，产物溶液透过超滤膜，没有反应的底物和酶溶液继续回到反应器中反应，超滤膜的截留分子量为1kDa，超滤压力维持在1.0kg/cm²，出肽速率为9ml/min同时根据透过产物的量，补充相同浓度麦胚溶液进入反应釜，根据反应釜中pH的变化，通过自动装置动态进行pH的调节，维持在所需的pH值附近。透过液用真空浓缩装置浓缩至固形物含量30％左右，用喷雾干燥进行干燥，得到粉状的麦胚ACE抑制肽产品，经测定其对ACE的IC₅₀值为0.801mg/mL。

实施例4

将脱脂小麦胚芽粉按照10％(w/v)的浓度加入水中，在pH值9.0下搅拌0.5h，离心获得上清液调节pH值到6.0，采用中温淀粉酶在70℃下酶解180min，加酶量为1％(w/v)；酶法降解淀粉后，调节pH到4，得到沉淀，用水溶解稀释，调节pH值至中性，喷雾干燥。

称取5kg麦胚蛋白，加入100倍重量的去离子水，搅拌溶解，配置成1％的麦胚溶液，均质后加入胰凝乳蛋白酶，加酶量麦胚蛋白质量的为8％，维持反应液pH值为7.0，在37℃进行酶膜耦合反应。酶解反应液送入到超滤装置，产物溶液透过超滤膜，没有反应的底物和酶溶液继续回到反应器中反应，超滤膜的截留分子量为1kDa，超滤压力维持在1.5kg/cm²，出肽速率为8ml/min。同时根据透过产物的量，补充相同浓度麦胚溶液进入反应釜，根据反应釜中pH的变化，通过自动装置动态进行pH的调节，维持在所需的pH值附近。透过液用真空浓缩装置浓缩至固形物含量30％左右，用喷雾干燥进行干燥，得到粉状的麦胚ACE抑制肽产品，经测定其对ACE的IC₅₀值为0.903mg/mL。