四种产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌及其功能性酸奶生产技术

摘要

本发明名称为四种产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌及其功能性酸奶生产技术，适用于发酵乳制品中降胆固醇的功能性酸奶和微生态制剂生产。本发明采用高通量筛选技术和邻苯二甲醛法获得高效降低胆固醇的菌株，牛津杯法复筛得到高产胆盐水解酶的菌株，苯酚－硫酸法获得高产胞外多糖的菌株。筛选的四种乳酸菌均具有优良的发酵性能。利用具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的干酪乳杆菌KL1(CGMCC №1809)和J1(CGMCC №1808)，乳酸乳球菌乳酸亚种KS4(CGMCC №1807)，嗜热链球菌Tx(CGMCC №1810)制得品质优良的酸奶，既具有降低血清胆固醇功能，又可利用菌体产生的胞外多糖替代稳定剂，解决了酸奶乳清析出问题。本发明制作功能性酸奶的发酵工艺简单，发酵周期短，成本较低，适于大规模工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及四种产胆盐水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)和胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)的乳酸菌及其功能性酸奶生产技术，适用于发酵乳制品中降胆固醇的功能性酸奶和微生态制剂的生产。

背景技术

益生菌(Probiotics)是指一类通过肠道定殖作用改善宿主特定部位微生态平衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它们通过改善肠道微生物生态平衡，控制肠道感染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症人对乳糖的利用，并能刺激特异性或非特异性免疫反应，具有免疫增强的作用。益生菌制品的活菌应该代谢稳定，活性较强，通过消化道后大量存活，进入肠道后发挥益生菌作用。目前用于生产益生菌剂的优良菌种有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的乳酸乳球菌乳酸亚种等。

早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或者双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血清胆固醇的含量。20世纪70年代，科学家先后通过对大量饮用酸乳等发酵乳制品的非洲Massai人血清胆固醇的研究，对新生儿的研究，对常饮酸乳的美国人的调查，以及直接对酸乳的研究等，均发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。迄今，国内外研究者对于乳酸菌降低胆固醇的作用机理尚存在不同观点，主要集中于以下三点：(1)乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；(2)乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；(3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。胆盐水解酶(BSH)是乳酸菌产生的代谢产物。该酶能在人体肝肠循环中将结合态胆盐降解产生氨基酸与溶解度较低的游离态胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。

有文献报道乳酸菌在亚优化生长条件下，出于对自身的保护作用，可分泌胞外多糖(EPS)。Whitfield等研究表明胞外多糖的形成有利于微生物抵抗不良环境因素，如干燥、渗透压条件、抗生素或毒物作用、巨噬细胞或噬菌体的侵袭等。自1982年日本学者Shiomi等人报道乳酸菌EPS具有抗肿瘤作用以来，引起了许多学者的注意。从报道的研究结果看，乳酸菌EPS主要有以下几个方面的功能：改善发酵乳制品组织状态，控制酸奶的脱水收缩，防止乳清析出；改善菌株对肠道黏膜的非特异性粘附，增强菌株对肠道的定殖作用；抗肿瘤作用；调节免疫系统作用；对细胞体具有保护作用；抑制肠道腐败菌的繁殖，防治结肠癌的作用。目前认为乳酸菌EPS抗肿瘤作用的机理有以下几个方而：(1)影响血液供应，鉴于细菌素能引起肿瘤细胞组织缺血性坏死，曾经设想多糖的抗肿瘤作用可能影响肿瘤的血液供应；(2)刺激某种器官或组织，分泌一种物质攻击肿瘤细胞；(3)细胞膜接触抑制作用。肿瘤细胞表面具有很强的负电荷，而有些多糖可以结合这些电荷，使细胞表面被“中和”从而有利于细胞接受信号终止分裂。

国内关于干酪乳杆菌的研究主要是其降血脂、抗高血压、治疗过敏性疾病等保健功效上，如上海光明乳业股份有限公司申请的“干酪乳杆菌Bd-II菌株及其在降低血脂方面的应用”，专利申请号为：CN03128995.9；干酪乳杆菌LC2W菌株及其在抗高血压方面的应用专利申请号为：CN03129450.2两项专利；景岳生物科技股份有限公司申请的：新的微生物株类干酪乳杆菌GM-080及其治疗过敏相关疾病的用途，专利申请号为：CN200410038566.X。

虽然国外关于干酪乳杆菌降低血清胆固醇功效的研究也有一项专利报道：Lactobacillus casei bd-II stain and used to reduce blood cholesterol(20060127380)，但是，目前国外几乎无关于乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌等菌株产胆盐水解酶的专利报道。虽然国内有一项“含罗伊氏乳杆菌的功能性酸奶及其制作方法(200310112715.8)”的专利报道，但是国内无利用降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌应用于功能性酸奶生产的相关文章报道和专利报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供四种具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌。

本发明所提供的乳酸菌是：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL 1菌株，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)J1菌株，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx，已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏号分别为：CGMCC №1809(菌株KL1)，CGMCC №1808(菌株J1)，CGMCC№1807(菌株KS4)，CGMCC №1810(菌株Tx)。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL 1，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)J1，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx，分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)。

在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1和J1菌株的菌落大小2～3mm，表面粗糙如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白色，半透明，菌落周围有溶解CaCO₃的透明圈，菌落有较高黏性；个体形态呈杆状，长短不等，短链状排列，有时菌体呈球形，G⁺无芽孢杆菌；乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx菌株的菌落大小为1～2mm，表面光滑，边缘整齐，呈圆形，无光泽，凸起，灰白色，半透明，菌落周围有溶解CaCO₃的透明圈，菌落有较高黏性。个体形态呈球形或卵圆形，一般成对或链状排列，G⁺兼性厌氧菌。

上述方法得到具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸乳球菌乳酸亚种KS4，嗜热链球菌Tx，干酪乳杆菌KL1和J1属于本发明保护范围。

本发明的第二个目的是提供四种乳酸菌制备功能性酸奶生产技术。

本发明所提供制备功能性酸奶的方法是由具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1和J1，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx四种乳酸菌制得。

所述方法中，用于制备功能性酸奶的发酵工艺条件是：发酵温度为37～43℃，接种量为2％～6％，Tx/KS4/KL1(或J1)接种比例为1∶1∶2、2∶1∶1、2∶1∶3，发酵时间为3.5～5.5h，蔗糖添加量为4％～8％(w/v)。

所述方法中制备功能性酸奶的最佳发酵工艺条件为：发酵温度为40℃，发酵剂接种量为4％，Tx/KS4/KL1(或J1)接种比例为2∶1∶3，发酵时间为4.0h，蔗糖添加量4～5％(w/v)。在此优化发酵条件下，成品酸奶凝乳时间短，乳凝固结实，无乳清析出，口感黏稠细腻幼滑，甜酸度适中，有浓郁的酯香风味。

利用产胞外多糖的益生菌替代酸奶稳定剂或增稠剂，即可明显改善酸奶稳定性和流变特性，又可利用产胆盐水解酶和胞外多糖的益生菌株大规模生产功能性酸奶。

上述方法得到功能性酸奶最佳发酵工艺条件及其产品与专用生产菌株也属于本发明保护范围。

附图说明

应用干酪乳杆菌KL1和J1、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4与嗜热链球菌Tx生产功能性酸奶工艺流程图说明如下：

(1)原料乳：制作酸奶的原料乳要求菌数一般低于10⁴个/mL，不含抗生素和消毒药，不宜选用患乳房炎乳。(2)净化：以离心机除去牛乳中的白细胞和其他肉眼可见的杂质。(3)标准化：原料乳的主要成分指标应符合食品卫生国家标准GB 5408-85。其总干物质应不低于11.5％，脂肪含量根据产品不同大体调整为4种：3.2％、2.5％、1.0％和＜0.1％，可通过脱除奶油或添加1％～3％的脱脂奶粉或稀奶油以调整总干物质或脂肪含量。(4)预热、配料和过滤：将原料乳加热至60℃左右，加入4％～5％(w/v)的蔗糖，溶解后过滤除杂。(5)均质：在均质机中于8～10MPa压力下对预热的原料乳进行均质处理。目的是使乳凝固均匀，质地更加细腻、平滑，亦可使脂肪球变小而防止脂肪上浮。(6)杀菌：将原料乳加热至90℃，保温5～10min。(7)冷却：经杀菌后的原料乳迅速冷却至40℃，待接种。(8)接种：加入单一工作发酵剂的总接种量为4％，菌种Tx、KS4与KL1(或J1)的单一发酵剂的接种比例为2∶1∶3。(9)分装：为避免杂菌侵入，分装于塑料小容器的操作应在无菌室中快速进行。(10)保温发酵：将塑料小容器置于发酵室中保持发酵温度40℃。当发酵乳酸度达到65°T，乳凝固性状良好时，即发酵成熟。发酵时间一般为4h。(11)冷却：将盛酸奶的容器从发酵室取出，用冷风迅速冷却至10℃以下。(12)冷藏与后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏于0～5℃冷藏室中保存，直至饮用。目的是防止酸奶继续发酵产酸造成pH过低而影响口感，并防止杂菌污染繁殖。冷藏条件下的后熟有利于酸奶风味物质的形成，最终获得风味柔和、浓郁的功能性成品酸奶。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1和J1，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx分离筛选于东北普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)，具有可靠的安全性，用此四种乳酸菌株生产的功能性酸奶凝乳结实，无乳清析出，口感黏稠、细腻幼滑，甜酸度适中，有浓郁的酯香风味。

本发明制作功能性酸奶的原料来源方便，发酵工艺简单，发酵周期短，操作简单，对设备要求低，成本较低，适于工业化生产。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积百分含量。实施例1、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1和J1，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx的筛选与鉴定

1、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶菌株的筛选

取藏灵菇滤液5mL注入带玻璃珠的45mL无菌生理盐水中，充分振荡30min，制成菌悬液，而后10倍梯度稀释成10^-4～10^-6的稀释菌液。以稀释倾注法接种平板，倒入含碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基，37℃培养24h，挑取有溶解圈的单菌落划线接种于MRS斜面培养基中，于37℃培养24h。革兰氏染色，视其个体形态和纯度。转接种于MRS液体培养基中，37℃增菌培养2～3代，再以1％～2％接种量转接入含胆固醇的I号培养基，37℃培养20h后，以邻苯二甲醛比色法测定I号培养基中发酵前后胆固醇的含量，并计算胆固醇降低率(％)。根据胆固醇降低率确定高效降胆固醇的菌株。具体测定方法：取0.4mL培养前后的发酵液于比色管中，加入0.2mL邻苯二甲醛(1mg/mL)和4mL混合酸(冰醋酸、浓硫酸等量混合)，充分混合后室温静置10min，以不含胆固醇的I号培养基为空白调0，于550nm测定吸光值(A)，在胆固醇-吸光值标准曲线上查得发酵前后胆固醇的含量(结果见表1)。

表1不同乳酸菌株降低胆固醇的初筛试验结果

研究表明，采用高通量筛选技术和邻苯二甲醛法获得高效降低胆固醇的乳酸菌是KS4、J1、KL1和Tx菌株。其中，KS₄菌株降低胆固醇能力最强，其次是J1、KL1和Tx菌株。它们在有关文献报道中属于降低胆固醇能力较强菌株。

将初筛后获得的具有高效降胆固醇的菌株，在含0.1％胆固醇和0.3％牛黄胆酸钠的MRS培养基平板上(分别以含0.1％胆固醇的MRS培养基、0.3％牛黄胆酸钠的MRS培养基作为对照)，对称放置牛津杯，加入0.1mL MRS培养菌液，于37℃厌氧培养3～4d后，观察牛津杯周围是否有银色沉淀现象，其结果见表2。阳性者以茚三酮法检测银色沉淀物中是否有胆盐的水解产物——氨基酸存在，根据蓝紫色反应初步确定菌株是否产生胆盐水解酶。将茚三酮反应阳性菌株划线接种于MRS斜面试管，培养后保存备用。

表2产胆盐水解酶乳酸菌株复筛试验结果

注：“+”表示牛津杯周围有不同程度的银色沉淀现象；“-”表示无沉淀现象。

由表1和表2结果显示，沉淀圈的大小与胆盐水解酶的活力和降低胆固醇的百分率成正比。复筛试验总体比较，菌株KS4、J1、KL1和Tx能够高产胆盐水解酶，其中菌株KS4产酶能力最强，其次是J1、KL1和Tx菌株。高效降低胆固醇的乳酸菌株源于其产生多量或高活力的胆盐水解酶。可利用这些高产胆盐水解酶的乳酸菌株进一步开发研制高效降胆固醇的功能性酸奶。

2、高产胞外多糖菌株的筛选

取藏灵菇滤液5mL注入带玻璃珠的45mL无菌生理盐水中，充分振荡30min，制成菌悬液，而后10倍梯度稀释成10^-4～10^-6。以稀释倾注法接种平板，倒入含碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基，37℃培养24h，挑取有溶解圈、黏性较高的单菌落划线接种于MRS斜面培养基中，于37℃培养24h。革兰氏染色，视其个体形态和纯度。转接种于MRS液体培养基中，37℃增菌培养2～3代，再以1％～2％接种量转接入MRS液体培养基中，37℃培养12h后，以苯酚-硫酸比色法测定培养液中EPS的含量。将测得样品吸光度y值代入标准曲线公式y＝0.8649x(R²＝0.9991)即得到EPS浓度x值(100mg/L)，其结果见表3。根据MRS培养基中的EPS含量，确定产胞外多糖的菌株。将产胞外多糖的菌株划线接种于MRS斜面试管，培养后保存备用。

表3分离菌株产胞外多糖测试结果

研究表明，采用高通量筛选技术和苯酚-硫酸法获得较高合成EPS的乳酸菌是KS4、KL1、J1和Tx菌株。其中KS4菌株EPS的产量最高，其次为KL1、J1和Tx菌株。它们在有关文献报道中均属于产EPS能力较强的菌株。

3、筛选菌株发酵性能鉴定

将筛选的KS4、KL1、J1和Tx菌株培养物转接入灭菌脱脂乳中连续传代活化2～3代，37℃培养过夜至牛乳凝固。再以1％接种量转接入盛脱脂乳的三角瓶中，于37℃培养过夜至牛乳凝固后，再冷藏后熟过夜，测定发酵剂的活力(包括凝乳时间、酸度、黏度、还原韧天青时间，乳酸菌活菌数量)。分别于37℃、40℃、43℃培养过夜至牛乳凝固后，进行感官综合评定，其结果见表4。根据发酵剂的活力和感官综合评定分数高低，确定发酵性能优良的菌株。将筛选产胆盐水解酶、胞外多糖和发酵性能优良的MRS斜面菌株，接种于各种理化鉴定培养基中，37℃培养进行鉴定。

表4筛选乳酸菌株的发酵性能测试结果

注：表中数据为n＝3测定之平均值。

研究表明，菌株KS4、KL1、J1和Tx均具有良好的发酵性能。其中由Tx菌株制备发酵剂的黏度最高，凝乳时间最短，感官综合评分最高，其次是J1、KL1和KS4菌株。可利用这些产EPS的乳酸菌株进一步开发研制具有良好稳定性的功能性酸奶。

4、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖菌株的鉴定

常规生理生化试验鉴定：糖醇类发酵试验，耐盐试验(7.5％NaCl)，不同温度试验(10℃、40℃)。Biolog全自动微生物鉴定仪鉴定：挑取MRS平板上的目的单菌落划线接种于BUA+B平板上(含5％无菌脱纤维绵羊血)，37℃培养得到单菌落后，以Biolog的专用接种液调整菌悬液的浊度至65±2％T，接种于AN微量鉴定板中，35～37℃厌氧培养24～48h后，于鉴定仪上读取鉴定结果。鉴定结果如表5所示。鉴定菌株KL1和J1为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，菌株KS4为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)，菌株Tx为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。

表5菌株KL1、J1、KS4、Tx的鉴定项目与结果

注：“+”95％以上的菌株为阳性；“-”95％以上的菌株为阴性。

实施例2、利用高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖菌株生产功能性酸奶

本发明所用的酸奶生产专用菌种是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1和J1，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)KS4，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Tx。它们均为高产胆盐水解酶和胞外多糖的功能性菌种。其中干酪乳杆菌KL1和J1菌株耐胃酸、耐胆汁盐能力较强，具有抗消化道逆环境特性，可顺利到达小肠分泌胆盐水解酶，将结合态胆盐降解产生氨基酸与溶解度较低的游离态胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。利用小白鼠做功能性酸奶经口灌胃试验，1个月后的结果表明，模型试验组小鼠血清的低密度脂蛋白浓度较模型空白组明显降低，并从小鼠粪便中分离筛选出菌株KL1的大量活菌，说明干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1能顺利通过消化道逆环境而到达小肠发挥高效降低血清胆固醇的功效。故可利用这些菌株生产降血清胆固醇的功能性酸奶。

1、单一发酵剂的制备

将10mL脱脂乳装入试管，经0.07Mpa灭菌20min，冷却至37℃，分别接种产胆盐水解酶和胞外多糖的干酪乳杆菌KL1或J1，乳酸乳球菌乳酸亚种KS4，嗜热链球菌Tx优良菌株，37℃培养至乳凝固，再以2％接种量制作发酵剂，37℃下培养至乳凝固，即为单一菌种发酵剂。

2、功能性酸奶生产发酵条件的优化

根据影响功能性酸奶品质较大的发酵温度、接种比例和接种量进行三因素三水平[L₉(3⁴)]正交试验(见表6)，并对成品酸奶的乳凝固时间、黏度、感官综合评分(总分80分，其中色泽5分、滋味和气体30分、组织状态15分、乳酸菌活菌数10分、黏稠度20分)，通过对试验结果的极差分析和方差分析确定其最佳发酵工艺条件。

表6功能性酸奶优化发酵条件正交试验设计因素水平表

表7发酵条件优化结果与初始发酵条件结果对照

为了获得更大活力和优良品质的功能性酸奶，针对其发酵条件进行了优化。通过正交试验，以凝乳时间、黏度和感官综合评分为评价指标，确定功能性酸奶最佳发酵条件为：发酵温度为40℃，发酵剂接种量为4％，Tx/KS4/KL1(J1)的接种比例为2∶1∶3，发酵时间为4.0h，蔗糖添加量为4％～5％(w/v)。在此优化发酵条件下(见表7)，成品酸奶黏度较高，凝乳时间较短，凝乳结实，无乳清析出，口感黏稠、细腻和幼滑，甜酸度适中，有浓郁的酯香风味。冷藏1周后其活菌数较高为9.6×10⁶cfu/mL，黏度仍较高，说明乳酸菌产生的胞外多糖对乳酸菌活性有一定保护作用，提高了生产菌种的抗逆性。冷藏两周后其乳清析出量保持较低水平，比普通酸奶乳清析出量减少约50％，解决了酸奶乳清析出的问题。故利用产胞外多糖的益生菌替代酸奶稳定剂或增稠剂，即可明显改善酸奶稳定性和流变特性，又可利用产胆盐水解酶和胞外多糖的益生菌株大规模生产功能性酸奶。

本专利所属项目：北京市教委农业应用新技术北京市重点实验室开放课题“开菲尔粒的菌种筛选及其在功能性发酵牛乳中的应用研究”

项目编号：KF2003-06

项目起止时间：2004.01-2006.12

项目负责人：刘慧