一种江米酒酒药微生物源凝乳酶的制备方法

摘要

一种江米酒酒药微生物源凝乳酶的制备方法。本发明利用江米面作为培养基，通过酒药发酵生产江米酒，采用硫酸铵分级沉淀法从江米酒中提取凝乳酶，进一步使用SephadexG－100和DEAE－Sephadex A－50纯化，得到高纯度的凝乳酶。以该方法产凝乳酶，原料来源广泛、成本低廉、操作简单、发酵周期短，所产凝乳酶活力高，纯化后凝乳活力达4360±50U/mg，蛋白回收率为16.21±1.98％。

说明书

【技术领域】

本发明属于生物制剂制备技术领域，特别涉及一种江米酒酒药微生物源凝乳酶的制备方法。

【背景技术】

凝乳酶(chymosin，EC3.4.23.4)是一种从未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是有限剪切酪蛋白的κ-酪蛋白中Phe105-Met106连接的肽键，导致牛奶凝结，因此被广泛用于干酪制造业，成为食品领域中重要的酶制剂，其产值占全世界酶制剂的15％。

凝乳酶的传统制备方法是将出生10-30天的小牛屠宰，从其第四胃中用盐将凝乳酶浸提出来。由于凝乳酶是干酪生产中的关键性酶，随着世界干酪产业的不断发展，每年宰杀5000万头犊牛以获得凝乳酶的方法，仍不能满足生产需要，也与现代工业发展极不协调。因此，研究者都在不断寻找新的来源，主要包括动物性凝乳酶、植物性凝乳酶及微生物源凝乳酶，但是这几种来源的凝乳酶又都具有一定的局限性。动物性凝乳酶受到来源限制，而且利用动物性凝乳酶生产的干酪不能满足素食主义者的需求。植物性凝乳酶虽然来源广泛，但是受到时间、地域、生长周期长等条件限制，很难发展。利用微生物生产凝乳酶是目前最有前途的发展方向，微生物生长周期短、产量大，受气候、地域、时间限制小，用其生产凝乳酶成本较低、酶提取方便、经济效益高，但是同时也存在着微生物产生其他非酶类代谢产物，一般微生物酶在成为商品时，都要进行毒性、致癌性以及皮肤过敏性测试，因而使得真正用于工业化生产凝乳酶的菌株很受限制。

江米酒是我国南方的一种传统食品，千百年前，我国就开始利用江米酒作为凝乳剂来制备干酪，而且已经有研究证明江米酒作为凝乳剂是江米酒中的凝乳酶在发挥作用，江米酒中的凝乳酶其实是江米酒发酵剂酒药中微生物代谢产物，属于微生物源凝乳酶，由于江米酒本身是传统食品，所以从江米酒中提取凝乳酶无需考虑微生物所产的非酶类代谢产物。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种江米酒酒药微生物源凝乳酶的制备方法。

本发明提供的江米酒酒药微生物源凝乳酶的制备方法，是利用江米面作为培养基，通过酒药(发酵剂酒药购自湖北省荆州市)发酵生产江米酒，采用硫酸铵分级沉淀法从江米酒中提取凝乳酶，进一步使用Sephadex G-100和DEAE-Sephadex A-50纯化凝乳酶，其具体步骤包括：

第一、江米酒的制备：以10g/100mL的江米面溶液、115℃灭菌20min，室温下冷却至30℃作为培养基，将酒药按0.0032g酒药/g江米面的接种量，加入前述冷却好的培养基中，140转/分钟振荡培养50～54小时，得到江米酒；

第二、离心：将第一步得到的江米酒在4℃、3500转/分钟条件下离心10min，取上清液备用；

第三、凝乳酶的提取：将硫酸铵烘干研细，取第二步得到的上清液，向其中缓慢加入硫酸铵粉末至其饱和度达到40％，4℃静置2小时后，以7000转/分钟离心15min，取上清液，继续加入硫酸铵粉末至其饱和度达到90％，4℃静置2小时，以8000转/分钟离心15min，沉淀溶于0.005mol/L、pH6.28的磷酸盐缓冲液中，4℃透析48小时，即为凝乳酶粗液。

第四、将上述第三步得到的凝乳酶粗液进行如下纯化：

首先利用Sephadex G-100凝胶柱层析纯化凝乳酶粗液，以0.005mol/L、pH6.28的磷酸盐缓冲液作为洗脱液，分步收集，检测收集液活性，合并有活性的洗脱液；

利用DEAE-Sephadex A-50进一步纯化，以0.02mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用NaCl梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶。

本发明的有益效果：1.以江米面为培养基利用摇瓶发酵生产江米酒，取代了传统江米酒繁琐的制备工艺，操作简单，节约原料。2.通过对摇瓶发酵条件的优化，提高了江米酒产凝乳酶的活力。3.通过对提取纯化工艺的控制得到了高纯度的凝乳酶。

【具体实施方式】

实施例1

在10个250mL摇瓶中，分别加入5.0g江米面、50mL水，摇匀，115℃灭菌20min，室温下冷却至30℃左右，分别加入0.016g酒药30℃、140转/分钟振荡培养50小时即为江米酒，测得江米酒中蛋白含量为1080.0mg，凝乳活力为21.89U/mg。

将各摇瓶中江米酒合并，在4℃，3500转/分钟离心10min，取上清液。向其中缓慢加入113.0g已烘干并研细的硫酸铵粉末，4℃静置2小时，离心(7000转/分钟、15min、4℃)，取上清液，继续加入167.5g已烘干并研细的硫酸铵粉末，4℃静置2小时，离心(8000转/分钟、15min、4℃)，沉淀溶于0.005mol/L、pH6.28的磷酸盐缓冲液，4℃透析48小时，即为凝乳酶粗液，该粗液中蛋白含量为604.8mg，凝乳活力为142.5U/mg。

首先利用Sephadex G-100凝胶柱层析对凝乳酶粗液进行纯化，0.005M、pH6.28的磷酸盐缓冲液作为洗脱液，分步收集，常规方法检测收集液凝乳活性，合并有凝乳活性的洗脱液，利用DEAE-Sephadex A-50进一步纯化，以0.02mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，以含0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L以及0.55mol/L NaCl浓度的缓冲液进行梯度洗脱，分步收集，检测凝乳活性，合并有凝乳活性的洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶。纯化后冻干得到172.8mg凝乳酶，凝乳活力达4282.5U/mg，计算得到蛋白回收率为16.00％。

实施例2

在10个250mL摇瓶中，分别加入5.0g江米面、50mL水，摇匀，115℃灭菌20min，室温下冷却至30℃左右，分别加入0.016g酒药30℃、140转/分钟振荡培养52小时即为江米酒，测得江米酒中蛋白含量为1135.4mg，凝乳活力为23.66U/mg。

将各摇瓶中江米酒合并，在4℃，3500转/分钟离心10min，取上清液。向其中缓慢加入113.0g已烘干并研细的硫酸铵粉末，4℃静置2小时，离心(7000转/分钟、15min、4℃)，取上清液，继续加入167.5g已烘干并研细的硫酸铵粉末，4℃静置2小时，离心(8000转/分钟、15min、4℃)，沉淀溶于0.005M、pH6.28的磷酸盐缓冲液，4℃透析48小时，即为凝乳酶粗液，该粗液中蛋白含量为624.5mg，凝乳活力为167.8U/mg。

首先利用Sephadex G-100凝胶柱层析对凝乳酶粗液进行纯化，0.005M、pH6.28的磷酸盐缓冲液作为洗脱液，分步收集，检测收集液活性，合并有活性洗脱液，利用DEAE-Sephadex A-50进一步纯化，以0.02mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用NaCl梯度洗脱，分布收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得到高纯度的凝乳酶。纯化后冻干得到173.5mg凝乳酶，凝乳活力达4326.6U/mg，计算可知蛋白回收率为15.28％。