一种植物乳杆菌发酵制备富含共轭亚油酸豆粕饲料的方法

摘要

一种植物乳杆菌发酵制备富含共轭亚油酸豆粕饲料的方法属微生物和动物营养与饲料技术领域。本发明的菌株(Lactobacillus plantarum ANCLA01)于2007年1月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册的编号CGMCCNo.1906。植物乳杆菌ANCLA01系从玉米青贮中分离、筛选、纯化培育出来，命名为植物乳杆菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)。该植物乳杆菌ANCLA01应用于豆粕发酵，可以提高发酵豆粕饲料中共轭亚油酸的含量，生产出富含共轭亚油酸的功能性发酵豆粕饲料。

说明书

本发明属微生物和动物营养与饲料技术领域，具体涉及一种高产共轭亚油酸(CLA，Conjugated linoleic acid)的新菌株及利用其发酵生产富含CLA的功能性豆粕饲料。

背景技术

利用乳酸菌发酵豆粕国内已有研究，但利用产CLA的乳酸菌发酵豆粕尚未报道。CLA具有抗癌、促进生长、抑制脂肪累积、增强机体免疫能力等功能，能提高猪、禽生长速度和瘦肉率，是当前药物、保健食品和动物营养等学科的研究热点。牛奶和牛肉、羊肉是人类最主要的CLA天然来源。人们通过二种日粮营养调控途径来提高反刍动物奶、肉中CLA含量：一是日粮添加油脂或改变日粮脂肪来源，以增加瘤胃中CLA代谢底物亚油酸的含量，进而提高畜产品中CLA含量；二是直接添加CLA或瘤胃保护CLA(即过瘤胃CLA)。但由于CLA价格昂贵，饲料中添加成本过高，生产实践中应用不多。因此，动物营养与饲料学家正在寻求其它提高畜产品中CLA含量的适用、低成本方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：旨在克服上述直接添加共轭亚油酸和改变日粮脂质结构的不足，提供一种能够高产共轭亚油酸的植物乳杆菌新菌株及利用其发酵制备富含共轭亚油酸豆粕饲料的方法，以提高反刍动物日粮中共轭亚油酸的含量。

本发明的植物乳杆菌新菌株系从自玉米青贮中分离、筛选、纯化和培育出来，命名为植物乳杆菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)。

该植物乳杆菌发酵制备富含共轭亚油酸豆粕饲料的方法是：先将该高产共轭亚油酸的菌株ANCLA01批量扩培后，再将豆粕去杂粉碎后，在豆粕粉中添加麸皮、碳水化合物、酵母、磷盐、食盐、镁盐，植物油脂和水，混合搅拌均匀消毒灭菌后，将植物乳杆菌ANCLA01或植物乳杆菌ANCLA01菌株培养液接种到豆粕中，控温发酵。

附图说明

图1为本发明的植物乳杆菌ANCLA01在显微镜下拍摄的照片；

图2为本发明的植物乳杆菌ANCLA01菌株PCR扩增条带照片；

图3为不同菌株生物转化共轭亚油酸的能力；

图4为植物乳杆菌ANCLA01对发酵底物中碳水化合物的利用。

本发明的植物乳杆菌ANCLA01(Lactobacillus plantarum ANCLA01)已按规定进行了保藏：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC；地址：中国.北京.中关村，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2007年1月8日；保藏登记入册的编号CGMCCNo.1906。

具体实施方式：材料与方法

1.1材料：玉米青贮采集于合肥市白帝乳业发展公司；培养基：pH6.5-6.8，MRS肉汤培养基，PY培养基，MRS固体培养基、MRS半固体培养基、MRS液体培养基和补添0.1g(100ml)^-1LA的MRS液体培养基。培养基用前均于121℃高压蒸汽下灭菌20min。

1.2主要试剂：LA和CLA：纯度≥99％，购自Sigma公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR试剂盒和胶回收试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.3菌种筛选：

1.3.1初筛：采集青贮后立即选取感官指标较好的青贮枝叶浸入37℃双蒸水中，十分钟后去除枝叶，吸取新鲜均匀浸泡液10mL加到500mL装有300mL MRS肉汤培养基的三角烧瓶中。37℃静止增菌96h后，稀释涂布平板法倾倒MRS琼脂平板，四区划线后于37℃厌氧培养48h，挑取单菌落穿刺接种于MRS半固体培养基中，37℃培养后防于冰箱保存。

1.3.2复筛：将初筛保存菌种于37℃活化后，按5％的接种量接种于装有10mL MRS液体培养基的带螺帽试管(d18mm×160mm)中，其中MRS液体培养基中亚油酸含量为0.1g(100mL)^-1。N²驱除空气，厌氧发酵24h后测定CLA，以筛选出产CLA细菌。

1.4CLA测定：以正己烷为溶剂，将CLA标样配成不同浓度的溶液，以正乙烷为参比，在233nm处测定其吸收值，以CLA浓度(ug/mL)为 横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。发酵液中CLA的提取按Jiang等(1998)方法操作。之后，将所获得脂肪酸提取物用5mL正己烷溶解，以不接种的发酵液提取物为参比，用紫外分光光度计再00-350nm范围内扫描，读取特征吸收峰233nm处的吸收值，根据标准曲线计算发酵液中CLA的含量(Pariza等，1999)。参比：培养基加入与样品同量的亚油酸，不接菌种，其它步骤同样品。

1.5菌种鉴定

1.5.1菌落及形态观察：将获得的高产菌株活化后，通过四区化线法接种于MRS平板培养基上，厌氧培养24h后观察菌落特征。革兰氏染色后于光学显微镜下观察菌株形态特征、长度范围和宽度范围等。

1.5.2生理生化鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》第九版(1994)，对获得的共轭亚油酸高产菌株进行接触酶反应、明胶液化试验、硫化氢反应、吲哚反应、温度生长等实验进行初步鉴定。从葡萄糖产酸、产气实验及甘露糖、棉子糖等生理和生化方面进行分类鉴定，实验参照《伯杰细菌鉴定手册》第九版(1994)乳酸菌分类鉴定及实验方法进行具体操作。

1.5.3分子生物学鉴定：模板的制备、菌株16SrDNA的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后目的片段的回收与纯化均按试剂盒说明步骤操作。然后将回收到的目的片段送至由宝生物工程(大连)有限公司测序。将测序结果运用BLAST软件与GenebanK中已登陆细菌的16SrRNA序列比较，找到与其相似性最高的登陆菌株序列号并调出其登陆粗劣，进行差异比较。

2.结果

2.1菌种的筛选：去除空气条件下发酵培养时，共分离出17株生成CLA能力较强的菌株。由表1结果可知，分离出的菌株CLA生成量在4.316-33.442ug/mL(湿基)之间，其中12号菌株CLA产量最高为33.442ug/mL。该菌株被命名为ANCLA01。

2.2菌种鉴定：

2.2.1菌种的菌落及形态观察

ANCLA01号菌株MRS固体培养后观察发现，菌落凸起、圆形、表面光滑并呈白色；如图1所示，革兰氏染色后油镜下观察发现，ANCLA01号菌株呈革兰氏阳性，菌体短直、两端钝圆，无芽孢，菌体宽在0.9～1.1um范围，长在2～7um范围内，菌体间成单体、队列或短链状。因此，ANCLA01号菌落形态与《伯杰细菌鉴定手册》中所描述的植物乳杆菌形态特征较为一致。

2.2.2生理生化检验

糖发酵试验表明，ANCLA01号菌株葡萄糖发酵结果无气体产生；生长温度检测发现，菌株15℃能增殖发育，45℃基本不生长；乳酸生成检测试验发现，发酵液中有乳酸生成。兼顾上述菌株形态特征，表明该菌属同型发酵B型乳酸杆菌。

2.2.2分子生物学鉴定

菌株差异比较发现，ANCLA01菌株16SrRNA序列的第5个碱基以后的1482个碱基序列与Lactobacillus plantarum strain L5的第26个碱基后的1482个碱基序列完全相同(序列已上传GenBank，登陆号EF185922)。该结果证实ANCLA01号菌株确系植物乳杆菌。

2.3不同发酵条件对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕中CLA产量的影响

2.3.1麸皮添加量对豆粕发酵产生CLA的影响

由于植物乳杆菌ANCLA01为兼性厌氧微生物，添加麸皮能增加豆粕间隙，有利于菌体生长。按1t豆粕添加麸皮10、15、20、25、30和35kg麸皮试验，发酵60h后发现：1t豆粕添加麸皮20kg时，菌体生长最好，CLA产量最高，达到12.46mg/g(DW基础)。

2.3.2不同碳源对豆粕发酵产生CLA的影响

豆粕中虽然含有少量糖分，但是远不能满足微生物生长需要。以豆粕为基础，按1t豆粕添加淀粉10、15、20、25、30和35kg淀粉试验或1t豆粕添加蔗糖10、15、20、25、30和35kg蔗糖，发酵60h后发现：1t豆粕添加淀粉25kg或蔗糖15kg时，菌体生长最好，CLA产量最高，达到14.53mg/g(DW基础)。

2.3.3.不同磷源对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕生产CLA的影响

磷酸盐能够缓冲在发酵过程中由于乳酸的产生而造成的培养基pH值下降，从而有利于CLA的产生。以豆粕发酵培养基为基础，在1t豆粕添加麸皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、NaCl 1.5kg的前提下，分别添加15kg磷酸氢钾、磷酸二氢钾，磷酸氢铵，磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸氢钠等6种磷盐发酵，发酵60h后发现：添加K₂HPO₄时，菌体生长最好，CLA产量最高，达到16.21mg/g(DW基础)。

2.3.4.K₂HPO₄剂量对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕生产CLA的影响

以豆粕发酵培养基为基础，在1t豆粕添加麸皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、NaCl 1.5kg的前提下，按1t豆粕添加淀粉10、15、20、25、30和35kg K₂HPO₄，发酵60h后发现：1t豆粕添加K₂HPO₄ 15kg时，菌体生长最好，CLA产量最高，达到18.68mg/g(DW基础)。

2.3.5.酵母膏对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕生产CLA的影响

植物乳酸杆菌是一类对营养要求较高的菌种，氮源被利用的难易程度必然影响该菌的初级代鲥，从而影响CLA的产量。CLA生产需要稀有氨基酸等生长因子，而酵母膏中含有这些生长因子，因此，在培养基中适量添加酵母膏有利于菌体生长，有利于CLA牛产。以豆粕发酵培养基为基础，在1t豆粕添加麸皮20kg、蔗糖10kg、K₂HPO₄15kg、NaCl 1.5kg的前提下，按1t豆粕添加酵母膏5、10、15、20、25、30kg，发酵60h后发现：1t豆粕添加酵母膏10kg时，CLA产量为20.36mg/g(DW基础)，加大酵母膏添加量，CLA产量不再明显提高。

2.3.5.食盐对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕生产CLA的影响

以豆粕发酵培养基为基础，在1t豆粕添加麸皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K₂HPO₄15kg的前提下，按1t豆粕添加淀粉0.5、1.0、1.5、2.0和2.5kg NaCl，发酵60h后发现：1t豆粕添加NaCl 1kg时，菌体生长最好，CLA产量最高，达到16.13mg/g(DW基础)。

2.3.7.镁盐对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕生产CLA的影响

以豆粕发酵培养基为基础，在1t豆粕添加麸皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K₂HPO₄15kg、NaCl 1.5kg的前提下，按1t豆粕添加0.1、0.2、0.3、0.4和0.5kg MgSO₄，发酵60h后发现：1t豆粕添加MgSO₄0.3kg时，CLA达到22.41mg/g(DW基础)。加大MgSO₄用量，CLA产量反而下降。

2.3.8.发酵时间对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕生产CLA的影响

以豆粕发酵培养基为基础，在1t豆粕添加麸皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K₂HPO₄15kg、NaCl 1.5kg、MgSO₄ 0.3kg的前提下，发酵时间按24、36、48、60、72、84、96h，结果发现：发酵48小时后时，CLA不再提高，达到24.15mg/g(DW基础)，表明最佳发酵时间为48h。

2.3.9.添加植物油脂对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕生产CLA的影响

以豆粕为基础，在1t豆粕添加麸皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K₂HPO₄15kg、NaCl 1.5kg、MgSO₄ 0.3kg的前提下，按1t豆粕添加葵花籽油10、15、20、25、30、35kg，或1t豆粕添加菜籽油或花生油10、15、20、25、30、35kg，发酵60h后发现：1t豆粕添加葵花籽油10kg，菜籽油或花生油30kg时，CLA产量最高，达到26.41mg/g(DW基础)。

2.3.10.植物乳杆菌ANCLA01接种量对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕生产CLA的影响

以豆粕为基础，在1t豆粕添加麸皮20kg、蔗糖10kg、酵母膏15kg、K₂HPO₄15kg、NaCl 1.5kg、MgSO₄ 0.3kg、葵花籽油10kg的前提下，植物乳杆菌ANCLA01接种剂量按6×10⁷、12×10⁷、18×10⁷、24×10⁷、30×10⁷、36×10⁷CFU/g风干豆粕或植物乳杆菌ANCLA01纯培养液添加量为150、300、450、600、750、900g/t风干豆粕，植物乳杆菌ANCLA01及其纯培养液用前须灭菌温水稀释10倍，便于均匀接种。发酵60h发现：1t豆粕乳酸菌接种剂量为12×10⁷CFU/g风干豆粕或植物乳杆菌ANCLA01纯培养液添加量为300g/t风干豆粕时，CLA产量最高，达到30.06mg/g(DW基础)。

2.3.11.发酵条件组合效应对植物乳杆菌ANCLA01发酵豆粕生产CLA的影响

在以上单因素试验的基础上，通过L₁₈(3⁷)正交优化设计考察各因素对豆粕发酵的整体影响。结果发现，影响植物乳杆菌ANCLA01产生CLA的各组分的主次顺序依次为：淀粉或蔗糖、K₂HPO₄、麸皮、酵母膏、NaCl、MgSO₄、发酵时间，最佳组合为：在1t豆粕添加麸皮20kg、淀粉25kg或蔗糖15kg、酵母膏10kg、磷盐15kg、食盐1kg、镁盐0.3kg，葵花籽油10kg(或菜籽油、花生油30kg)，乳酸菌接种量为12×10⁷CFU/g风干豆粕或乳酸菌纯培养液添加量为300g/t风干豆粕，此时CLA产量高达36.42mg/g(DW基础)。

利用该植物乳杆菌发酵制备富含共轭亚油酸豆粕饲料的方法：

1)对植物乳杆菌ANCLA01菌株进行批量扩培：用上述MRS液体培养基将保存菌株活化两次后，接种于250mL三角瓶中，每瓶装液量100mL，37℃恒温静置培养48～72h后，再按2×10⁷CFU/mL添加浓度添加到液态种子发酵罐中，混合均匀后于37℃条件下培养发酵48h；

2)在豆粕饲料中接种植物乳杆菌ANCLA01：将豆粕去杂粉碎至60-80目后，按1t豆粕添加麸皮20kg、淀粉25kg或蔗糖15kg、酵母膏10kg、磷盐15kg、食盐1kg、镁盐0.3kg，植物油脂(葵花籽油10kg，菜籽油或花生油30kg)10-30kg，水1t，混合搅拌均匀后115℃条件下灭菌20min，待温度降至35-39℃时，再按乳酸菌剂量12×10⁷CFU/g风干豆粕或乳酸菌纯培养液添加量为300g/t风干豆粕，向豆粕中喷洒接种植物乳杆菌ANCLA01(乳酸菌及其纯培养液用前须灭菌温水稀释10倍，便于均匀接种)，在35-39℃条件下厌氧发酵48h。多批发酵后经实测CLA含量均超过30.52mg/g(DW基础)以上。