蛋白质相互作用分析用的抗标记抗体芯片

摘要

本发明的目的是不论蛋白质的种类如何，都可以在固相上高密度高通量地进行蛋白质的功能分析。本发明的特征在于：在维持目标蛋白质的结构和功能的状态下，固定蛋白质于支持体上并进行蛋白质的相互作用分析。例如，通过基因工程技术，在其一末端融合肽或者多肽以形成标记的状态下，制备目标蛋白质。同时，通过经由形成于支持体上的抗标记抗体所组成的层结合目标蛋白质，在固相上保持游离状态的同时，阵列目标蛋白质，并进行其相互作用分析。通过本发明，可以进行目标蛋白质的相互作用的分析而不影响该蛋白质的不稳定结构和功能。例如可以用作蛋白质的相互作用分析、筛选、定量、表达图谱等的平台。

说明书

技术领域

本发明涉及用于高密度且高通量地在固定相上一并实施蛋白质的功能分析的抗标记抗体芯片，及其相关技术。

背景技术

随着各种生物种类基因组分析的进展，大量碱基序列信息的蓄积正形成世界规模。在生物体内基于这些碱基序列信息经过转录以及翻译过程，蛋白质被合成，通过该机能，维持着生物体的各种活动。随着基因组信息的充实，近年，对担负生物体内的功能分子的角色的蛋白质的结构以及功能进行分析正不断盛行，被称作蛋白质组学或蛋白质组(proteonome)分析。

在液相中进行蛋白质功能分析的例子可以举出酶活性测定试验和抑制剂实验。前者是研究在试管内使酶与底物在溶液中反应来测定酶活性时的最佳条件的实验，后者是通过在该反应液中添加物质来寻找抑制酶反应的物质的实验。

例如，参与黑色素合成的酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)催化单羟基酚类(酪氨酸等)→二羟基酚类(多巴等)→醌(多巴醌等)的反应。因而，可以通过使酪氨酸酶溶液与酪氨酸溶液反应，以分光光度法分别测定280nm和475nm的吸光度，从而测定多巴和多巴醌随时间的生成量。通过最优化此时的反应温度、反应组成、反应时间、pH等各条件来确立实验体系。通过在该反应溶液中添加物质来寻找抑制反应的物质。例如，添加酪氨酸酶活性抑制剂曲酸，可以得到抑制多巴和多巴醌的生成的结果。

对于在上述这样的液相中进行蛋白质功能分析，作为在固相上蛋白质组学分析的例子，可以考虑通过质谱分析法等进行蛋白质结构分析的技术。虽然已提出了用于此的将蛋白质固定于支持体的蛋白质固定化技术，但是其特征在于在结构分析时不需要维持蛋白质的功能。另外，也在尝试通过表面质粒基因组共振法或晶体振荡器微量天平法进行蛋白质间相互作用分析，但是，都没有达到对一定数量的样品一起进行相互作用分析。

特别地，为了高密度且高通量地在固相上进行蛋白质的功能分析，需要花费功夫使得在保持不稳定的蛋白质的结构和功能得到维持的状态将蛋白质固定于支持体。将蛋白质固定于支持体，可以举出物理吸附或经由各种化合物的官能团的结合，包埋于聚合物层中的方法等。另外，也有例如使用杯芳烃这种宿主/客体捕捉蛋白质的方法。每一种方法都可以将蛋白质固定在支持体上，但是，都没有考虑维持蛋白质的结构和功能。

目前，存在一些称作蛋白质芯片的市售产品。例如，水凝胶(hydroGel)(PerkinElmer公司)或动力基质片(Power Matrix Slide)(Full MoonBioSystems公司)具有通过重叠在玻璃基板上的聚合物凝胶，三维地捕捉蛋白质分子的结构，而FAST Slide(Schleicher & Schuell公司)则是将硝酸纤维素膜粘附在玻璃基板上而得到的产品。另外，其他各个公司的玻璃基板表面经过醛基、环氧基、氨基等修饰的芯片也是以能适用于蛋白质固定的形式出售。

作为应用，例如已提出了利用水凝胶或FAST Slide的芯片基质的免疫检测法。它是在芯片上固定抗体，测定特异性结合的抗原量的方法。尽管在保持抗原(目的蛋白质)的结构和功能方面下了工夫，但并不在芯片上分析相互作用。

蛋白质芯片即使在蛋白质组学分析中，也期待作为功能分析用的一种工具，但是，将蛋白质直接或使用蛋白质固定试剂固定在载玻片等的支持体上时，不能维持蛋白质的结构和功能的情况较多。

另一方面，现在使用DNA微阵的表达图谱正在盛行。表达图谱是通过包含地分析在生物体内表达的基因，由其类型进行该生物体的特征赋予。例如通过比较某种疾病的患者和非患者的基因表达类型，确定与该疾病相关的基因，同时，可以能够用于开发和评价使该基因表达的正常化或抑制翻译产物的功能等的药剂的的技术。但是，在生物体内的基因主要是担负信息分子的角色，基因本身例如并不会引起疾病。在生物体内担负功能分子的角色的是作为基因的翻译产物的蛋白质。另外，由于很多时候基因的表达量和疾病之间并不是一定相关，因此，较之通过基因的表达图谱，通过蛋白质的表达图谱，更期待能够正确地评价生物体内的功能变化。

[非专利文献1]Yoshimura，T.et al.，The Journal of biological Chemistry，278(52)，53105-53111(2003)

发明内容

本发明的目的在于不论蛋白质的种类，在固相上高密度且高通量地进行蛋白质的功能分析。

本发明的特征在于：在维持目标蛋白质的结构及功能的状态下，固定蛋白质于支持体，进行蛋白质的相互作用分析。

例如，通过基因工程技术，以在某一末端融合标记肽或多肽的状态，制备目标蛋白质。然后，经由形成于支持体上的抗标记抗体所组成的层，结合目标蛋白质，在保持在固相上游离状态的同时，阵列化目标蛋白质，并进行其相互作用分析。

通过本发明，能够进行目标蛋白质的相互作用分析而不会损害目标蛋白质的不稳定结构和功能。例如，能够适用作蛋白质的相互作用分析、筛选、定量、表达图谱等的平台。

附图说明

图1是抗标记抗体芯片的结构示意图。

图2是抗标记抗体芯片的读取装置的示意图。

图3是抗标记抗体芯片的样品分注装置的示意图。

图4是抗标记抗体芯片的制作过程。

图5是抗标记抗体芯片的使用过程。

图6是表示荧光检测结果的图表。

其中，1：芯片、2：点、3：支持体、4：蛋白质固定试剂、5：标记融合目标蛋白质、6：抗标记抗体、7：标记、8：目标蛋白质、9：相互作用物质、10：检测装置主体、11：控制·分析末端、12：光源、13：分离器、14：透镜、15：芯片、16：固定器、17：载物台、18：反射镜、19：过滤器、20：透镜、21：小孔、22：检测器、30：控制装置、31：分注装置总体、32：导轨、33：定位搜索装置、34：冲头、35：喷嘴、36：喷嘴清洗装置、37：喷嘴干燥装置、38：样品、39：芯片、40：泵、41：泵、42：温度·湿度传感器。

具体实施方式

以下参照附图，说明本发明的上述及其它的新颖性特征和效果。但是，附图是专门用于解说用的，并没有限定本发明的范围。

图1是本发明实施例的抗标记抗体芯片的结构示意图，由芯片1、芯片1的局部放大图、以及芯片1和标记融合目标蛋白质5经由抗标记抗体6而结合的状态的标示图组成。

芯片1的纵横向设置有m×n个点2。芯片1由支持体3和其表面经过处理的蛋白质固定试剂4的层构成，该蛋白质固定试剂4的层经由抗标记抗体6结合标记融合目标蛋白质5。标记融合目标蛋白质5是由目标蛋白质8和标记7构成，通过标记7部分与抗标记抗体6结合。目标蛋白质8是与各种物质反应或不反应，其中，通过与相互作用物质9结合，来检测相互作用的有无。

本发明实施例的蛋白质相互作用分析装置包括，上述抗标记抗体芯片、分注含标记融合目标蛋白质的样品在抗标记抗体芯片上的分注机构、反应结束的抗标记抗体芯片的标识样品的读取机构。

图2是抗标记抗体芯片的读取机构的示意图。芯片15安装在固定器16上，借助载物台17能够在X-Y方向上移动。从光源12出来的检测光由分离器(スピリツタ一)13反射，由透镜14聚光并照射到芯片15上。芯片15的发射光通过透镜14和分离器13，由反射镜18反射后，通过滤光器19，由透镜20聚光，通过小孔(pin hole)21后，由检测器22检测。光源12、台架17、检测器22等由检测装置主体10以外的控制·分析末端11控制。

图3是抗标记抗体芯片的样品分注机构的示意图。喷嘴35固定在冲头34上，该冲头34随定位搜索装置33在导轨32上移动。通过喷嘴35将样品从样品38分注到芯片39。喷嘴35在操作中适宜用喷嘴清洗装置36清洗，喷嘴干燥装置37干燥。分注机构总体31内设置有温度·湿度传感器42，定位搜索装置33、泵40、41等都通过控制装置30控制。

目标蛋白质通过基因工程技术，以融合构成的肽或者多肽的状态制备，通过标记和抗标记抗体之间的抗原抗体反应将目标蛋白质排列在固相上。

本发明实施例与历来的方法不同，为了保持在固相上维持目标蛋白质的结构和功能的状态，在芯片上形成由抗标记抗体构成的层，并对此进行标记融合目标蛋白质的阵列化。抗标记抗体特异性识别并结合构成标记的抗原，但并不是与目标蛋白质直接结合。由此，通过以不影响目标蛋白质的结构与功能的状态，间接固定，能够实现阵列化。

另外，标记融合目标蛋白质向固相的固定化，由于通过在支持体上形成层的抗标记抗体和标记之间的抗原抗体反应，因此仅仅混合两者结合反应就发生。此时，仅使用溶解一般蛋白质时所用的缓冲液(例如磷酸缓冲液等)，而不需要更换为特殊条件。

在抗标记抗体芯片上进行与目标蛋白质相关的相互作用分析。在抗标记抗体芯片上，维持目标蛋白质自身处于游离状态，由于仅通过在该末端附加的标记与抗标记抗体结合，因而，目标蛋白质在维持其结构和功能的状态下，实现在芯片上的阵列化。因而，通过本发明实施例，能够在维持芯片上通常不稳定的蛋白质于原状态的同时，进行相互作用的分析。不论和目标蛋白质相互作用的物质种类(例如蛋白质、核酸、糖、化合物、病毒、细胞等及其混合物)如何。另外，使目标蛋白质和物质相互作用后，可以再和其它物质相互作用。

支持体只要是固相，则可以是任何种类的材质。例如，可以举出玻璃、树脂、晶片等，形状是例如平板、球状、槽状、筒状等种类都可以。大小只要在能够适用于使用装置的范围就可以。

图4表示抗标记抗体芯片的制备流程的一个例子。

在支持体上涂敷用于固定蛋白质的试剂(例如杯芳烃等)。这时，根据需要也可以涂敷对支持体表面和蛋白质固定试剂结合起中介作用的试剂(例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷等之类的硅烷偶合剂)。例如，杯芳烃时，在支持体上涂敷3-氨基丙基三乙氧基硅烷后，通过杯芳烃分子的醛基和3-氨基丙基三乙氧基硅烷分子的氨基形成的甲亚胺键进行固定，从而涂敷整个芯片。

抗标记抗体制造用的支持体可以是上述以外的例如玻璃基板表面粘附有硝酸纤维素膜或聚合物凝胶，或者也可以是玻璃基板表面经过各种官能团修饰的支持体。

抗标记抗体经由蛋白质固定试剂固定于支持体。抗标记抗体紧密固定使得在点区域内形成饱和状态，从而在支持体上形成由抗标记抗体组成的层。抗标记抗体不能结合的部位，一般通过使用封闭剂例如牛血清白蛋白(BSA)等蛋白质将该部分包埋，使得目标蛋白质不直接接触支持体或蛋白质固定试剂。由于在目标蛋白质的末端融合有构成抗原的标记，因而抗标记抗体仅识别并结合标记，并不与目标蛋白质结合。由此，目标蛋白质自身常常保持在游离状态，同时，仅经由标记结合于抗标记抗体，从而在芯片上实现阵列化。

图5表示抗标记抗体芯片的使用流程。

标记融合目标蛋白质的制备通过基因工程技术进行。把编码目标蛋白质的DNA片段连接到表达载体(例如pET载体、pGEX载体等)中。表达载体选用能够在目标蛋白质的末端等融合标记的载体，通过适于该载体的表达系统，高表达标记融合目标蛋白质。标记融合目标蛋白质的提纯是使用与该标记特异性结合的物质(例如抗标记抗体或基质等)，通过利用亲和性的亲和提纯法回收。

在目标蛋白质的末端区域，融合标记存在障碍时，也可以设计使得标记导入到蛋白质内部。本发明实施例提供，有效利用基因工程上的自由进行标记对目标蛋白质的融合，并配合目标蛋白质的特性，通过标记和抗标记抗体的结合实现对芯片的阵列化的技术。

标记种类，由于假设标记融合目标蛋白质可以基因工程的方式表达，因此优选肽或者多肽(蛋白质)。但是，例如以谷胱甘肽-S-转移酶之类的蛋白质作为标记添加在蛋白质上时，与例如以六个组氨酸(hexahistadine)之类的肽作为标记添加时相比，标记的分子量更大，因而，根据目标蛋白质的特性，认为有些蛋白质容易受其影响。因而，作为本发明实施例的标记，相比多肽，更优选肽。

近年，由于各种生物种类的基因组分析正盛行，与蛋白质信息相比，基因信息量显著增加。因而，根据基因信息分析其转译产物即蛋白质正趋于普遍。此时，使用先进的基因工程技术由基因生物合成蛋白质时，为了更加有效精制合成的蛋白质，以在蛋白质的末端融合被称作标记的肽或者蛋白质的状态合成，使用特异性识别标记的物质(例如抗标记抗体或基质等)亲和精制标记融合目标蛋白质。本发明实施例提供用于分析合成的标记融合目标蛋白质直接在固相上的相互作用的技术。

历来，通过基因工程技术合成的标记融合目标蛋白质，在利用与标记的亲和性进行亲和精制后，使用例如凝血酶等之类特定的蛋白质分解酶切断标记和目标蛋白质后，再次使用亲和精制法从目标蛋白质的馏分中除去标记碎片和未被消化的标记融合目标蛋白质，回收目标蛋白质并用于分析。本发明实施例的特征在于，不需要切断分离标记和目标蛋白质，而是将标记活用为对芯片的结合介质，与历来方法相比，可以简化操作工序。

如图5所示，本发明实施例通过基因工程技术可以同时亲和精制表达的标记融合目标蛋白质的和固定于芯片。在历来的技术中，如果不经过表达的标记融合蛋白质的亲和精制、用蛋白质分解酶等切断标记和目标蛋白质、从标记和目标蛋白质的混合溶液中回收目标蛋白质、浓缩目标蛋白质等工序，就不能够适用于目标蛋白质的相互作用分析。本发明实施例由于在固相上形成由抗标记抗体所构成的层，因而不用精制合成的标记融合目标蛋白质，例如以大肠菌表达体系合成标记融合目标蛋白质时，通过将细胞破碎物直接提供给芯片，可以在亲和精制标记融合目标蛋白质的同时，固定于芯片。由此，操作工程明显简化，同时，可以有效用于在固相上分析目标蛋白质的相互作用，而不导致目标蛋白质的回收率降低。这可以适用作例如同时进行表达量低的目标蛋白质的精制和阵列化的一步法。

通常使用基因工程技术生物合成目标蛋白质时，以目标蛋白质的末端融合标记的状态进行合成，并利用对该标记的亲和性进行亲和精制。因而，通过将标记的种类统一，可以实施同样的精制法。这种情况下，当合成的标记融合目标蛋白质在芯片上阵列化时、不管目标蛋白质的种类如何，都可以共同使用对融合标记的抗标记抗体。因此可以提供根据抗标记抗体的种类制备的抗标记抗体芯片产品。

本发明实施例由于不论蛋白质的种类如何，都能够以维持其结构和功能的状态，在固相上阵列化，进行相互作用分析，因此可以适用作固相上的蛋白质的相互作用分析用平台。因此，通过组合检测机构(图2)或样品分注机构(图3)等分析所需的外周设备，可以提供作为全自动或半自动的蛋白质相互作用分析系统。

相互作用的检测在检测荧光标识样品时，可以使用例如荧光扫描仪或者双光子激发扫描仪等。另一方面，非荧光标识样品时，可以使用例如表面等离子体激元共振装置或者光导波路装置等。

将抗标记抗体、标记融合目标蛋白质以及能够与其相互作用的物质等分注在固相上，例如不仅可以使用微量加样器等进行手工操作，也可以构建通过接触型或者非接触型的样品分注机构等进行全自动或者半自动分注处理系统。

需要对芯片上的同一点反复分注样品时，例如预先在芯片上设定位置识别用记号，通过样品分注装置上的定位搜索装置(例如CCD照相机等)识别芯片上的记号，存储和计算点的位置。

芯片表面的封闭、清洗等操作不仅可以使用例如槽等进行手工操作，也可以构建通过混合装置等进行全自动或者半自动处理系统。

本发明实施例，在运用近年普及和发展的基因工程技术的同时，意味着可以广泛且普遍地在芯片上实现复杂的蛋白质的相互作用，不仅可适用于与蛋白质相关的用途研究，而且适用于医疗、检查、诊断或制药领域的筛选等。特别地，蛋白质由于与基因等信息分子不同，实质上是掌控生物体内各种作用的功能分子，因此可以有效地在芯片上广泛且普遍地实现其相互作用。

另外，由于只要在使用的固相阵列化面的范围内，标记融合目标蛋白质的点数就可以适宜变化，因此可以随着高密度化实现小规模。另外，不论目标蛋白质的种类如何。因而，根据本发明实施例原理，所有的蛋白质都可以在芯片上固定，并用于相互作用分析。在可以进行与目标蛋白质相关的筛选、定量、表达图谱等的功能分析的同时，也可以应用于结构分析。

本发明实施例由于能够在维持蛋白质结构和功能的状态下，实现蛋白质在固相上的高密度阵列化，进行相互作用分析，因此可以说是适用于蛋白质的表达图谱的技术。如DNA微阵直接研究生物体内的作为翻译产物的蛋白质的表达量比研究基因的转录产物的表达量更能准确反映生物体内功能分子的状态，因此能够期待根据蛋白质芯片的相互作用分析或表达图谱在今后得到普及。本发明实施例在可以提供用于此的平台的同时，也适用于与蛋白质相互作用分析相关的委托分析服务化。

[验证试验]

[本试验的目的]

已知Ec DOS蛋白质和组成其一部分的PAS域蛋白质通过相互作用而结合(Yoshimura，T.et al.，The Journal of biological Chemistry，278(52)，53105-53111(2003))。此处，如图5所示，通过基因工程技术分别配制各部分后，将标记融合Ec DOS蛋白质在芯片上阵列化，探讨PAS域蛋白质浓度依赖性结合。

[来自标记融合Escherichia coli的direct oxygen sensor标记蛋白质(EcDOS)以及构成它的血红素结合PAS域的标记融合蛋白质的制备]

将编码Ec DOS蛋白质的开放阅读框区域克隆到pET28a(+)表达载体(Novagen)的相应多克隆位点。同样地，对于构成Ec DOS蛋白质的PAS领域，也另外进行克隆。在BL21感受态细胞(competent cell)(Stratagene)内，分别高表达各蛋白质后，将细胞破碎，回收上清。经硫酸铵盐析后，用Sephadex G-25柱(Amersham Biosciences)进行脱盐处理，将得到的洗脱液提供给Ni-NTA-agarose柱(Qiagen)，亲和精制各组氨酸标记融合目标蛋白质。关于标记融合PAS域蛋白质，用凝血酶消化分离组氨酸标记领域，将其产物提供给镍络合载体，回收除去标记的PAS域蛋白质上清液。所得的PAS域蛋白质用Cy3标记试剂盒(Amersham Biosciences)进行荧光标识。

[抗标记抗体芯片的制作]

抗标记抗体芯片按照图4的过程制作。固定抗标记抗体的芯片使用市售的蛋白质芯片(ProteoChip A，日立高科技(ハイテクノロジ一ズ))。ProteoChipA是将洗净的玻片氨基硅烷偶合化后，涂敷作为蛋白质固定试剂的杯芳烃分子而得到的。在本发明实施例中，在同一芯片上贴附预先开启有Φ2.0mm的定位用的小孔的点封条(已申请实用新型)，在其点内分注样品，进行目标蛋白质的相互作用分析。在本发明实施例中，抗标记抗体使用抗His-tag单克隆抗体(MAB050，R&D Systems)。该抗体用抗体用稀释溶液(含30％甘油pH7.4的PBS缓冲液)制备为100μg/ml的浓度，在各点分注1.5μl后，在37℃孵育一晚，从而将抗体固定在芯片上。芯片在清洗溶液A(含有0.5％Tween-20pH7.8的PBS缓冲液中浸渍并振荡20min，除去过量的抗体后，用去离子水冲洗。接着，将芯片浸渍在用PBS缓冲液(pH7.4)配制的3％BSA溶液中，室温振荡60min，进行封闭。封闭后的芯片浸渍在清洗溶液A中，振荡20min清洗后，再用去离子水冲洗，作为抗标记抗体芯片。

[通过标记融合Ec DOS蛋白质的固定的相互作用分析用芯片的制作]

在抗标记抗体的各点，分注1.5μl用蛋白质稀释溶液(含10％BSA和30％甘油的pH为7.4的Tris缓冲液)配制的100μg/ml的融合Ec DOS蛋白质后，室温孵育3hr。芯片在清洗溶液B(含0.5％Tween-20的pH7.4的Tris缓冲液)浸渍并振荡20min，除去过量的标记融合目标蛋白质后，用去离子水冲洗，从而制作阵列化标记融合Ec DOS蛋白质的相互作用分析用的芯片。

[Ec DOS蛋白质和PAS域蛋白质的相互作用分析]

在阵列化标记融合Ec DOS蛋白质的相互作用分析用的芯片的各点上，分注1.5μl用蛋白质稀释溶液在0～10μg/ml的范围内分5个阶段稀释的Cy3标记PAS域蛋白质，室温孵育3hr。接着，芯片在清洗溶液B中浸渍并振荡20min，清洗后，用去离子水冲洗，从而除去未结合的Cy3标记PAS域蛋白质。通过吹氮气除去芯片上的水滴后，用荧光扫描仪(ScanArray Express，Perkin Elmer)进行荧光检测，结果示于图6。

根据图6的结果，由于荧光强度随Cy3标记PAS域蛋白质发生浓度依赖性变化，因而认为本发明实施例可以在芯片上实现Ec DOS蛋白质和PAS域蛋白质的相互作用。这指示，在维持目标蛋白质的结构和功能的状态下，可以在芯片上阵列，同时通过与能够和其相互作用的物质反应，可以监测两者的相互作用。芯片化的优点之一是高集成化，借此，制作高密度地阵列化例如制药靶点蛋白质的芯片后，通过使作为制药候选的大量低分子化合物等一并与芯片上的蛋白质点分别反应，可以筛选显示相互作用的低分子化合物。

[工业应用]

本发明不仅适用于与蛋白质相关的用途研究，还可以应用于医疗、检查、诊断或者制药领域。