大脑突触体蛋白质差异表达和相互作用分析

摘要

哺乳动物大脑是信息处理中心以及各种生理活动和行为的控制中心。突触是大脑神经元之间发生功能联系的部位，许多与突触功能有关的生理生化过程如神经递质释放与激活、神经递质受体的调节以及信号传导级联放大等都是由突触中构成复杂网络的突触蛋白相互协调完成的。因此，深入开展突触蛋白及其相互作用和突触蛋白在不同生理病理条件下的差异表达研究将有助于进一步了解突触的结构与功能。本论文研究主要利用蛋白质组学及相关技术研究哺乳动物大脑突触中与突触传递有关的蛋白质相互作用和突触蛋白在终末糖基化产物累积过程中的差异表达，以发现和鉴定新的与特定受体和离子通道相互作用的蛋白，从而加深对突触传递分子机制的了解。
　　 已有证据表明，给C57 BL/6小鼠注射高剂量的半乳糖会导致终末糖基化产物(AGEs)的累积，从而引发糖尿病以及糖尿病并发症。如，糖尿病神经病变是糖尿病并发症中的一种，该疾病能使病人的学习能力和记忆能力减弱。学习和记忆能力减弱的根源在于突触蛋白以及蛋白质复合物的表达发生了改变。为了探讨AGEs诱导的突触蛋白的差异表达，我们给C57 BL/6小鼠注射高剂量的半乳糖后采用blue native/SDS-PAGE结合iTRAQ标记技术分析了小鼠大脑皮质中差异表达的突触蛋白。发现84个蛋白质的表达水平在AGEs累积过程中发生了变化。这些差异表达的蛋白质主要涉及神经递质释放、能量代谢以及信号传导等过程，说明在AGEs累积过程中，能量代谢和神经信号传递过程被削弱。阐明AGEs累积导致的差异表达蛋白有助于我们了解糖尿病神经病变中学习和记忆能力减弱的分子机制并为治疗这些疾病提供参考。
　　 突触结合蛋白Ⅰ是突触囊泡膜上一种与Ca2+调控的胞吐作用有关的重要蛋白质，能感受钙内流并引发囊泡的融合和神经递质的释放。尽管有很多关于这个蛋白质的研究，但目前对于突触结合蛋白Ⅰ在突触传递过程中的具体功能和作用机制仍不很清楚。突触结合蛋白Ⅰ分子中特异蛋白质互作结构域的存在使人们推测它们可能与多种涉及突触传递的蛋白质结合，从而发挥调节作用。本研究在鉴定能与突触结合蛋白Ⅰ结合的可能的新蛋白时，通过blue native PAGE发现了一个新的能与突触结合蛋白I相互作用的低分子量GTP结合蛋白一Rab3A，然后利用大鼠突触质膜蛋白提取物用免疫共沉淀实验证实了Rab3A能以不依赖于Ca2+的方式与突触结合蛋白Ⅰ产生很强的相互作用。通过定点突变和GST pull down实验对突触结合蛋白Ⅰ中Rab3A的结合位点进行了分析，发现突触结合蛋白工分子中C2B结构域的KKKK模体为Rab3A结合所必需；肌酸6磷酸能调节Rab3A与突触结合蛋白Ⅰ的结合。鉴于Rab3A能抑制神经递质的释放且与tSNAREs复合物(突触融合蛋白/SNAP-25)中的突触融合蛋白在突触结合蛋白Ⅰ中的结合位点相同，推测Rab3A可能与突触融合蛋白竞争性结合突触结合蛋白Ⅰ分子中的相同位点，通过影响突触结合蛋白Ⅰ与突触融合蛋白/SNAP-25复合物的相互作用而达到抑制膜融合和神经递质释放的目的。我们设计了一个体外实验验证这一推测。本部分研究证实，Rab3A是突触结合蛋白Ⅰ的一种新的相互作用蛋白，它们间的直接相互作用在突触传递的膜融合调节中起着十分重要的作用。研究结果加深了我们对突触传递调控机制的了解。
　　 电压门控钾离子通道Kv1.4是突触前膜中一种重要的A型钾离子通道，此通道能调节中枢神经系统神经元的兴奋性。Kv1.4在膜上的表达、定位、通道动力学以及翻译后修饰等都受其相互作用蛋白的调控。尽管已有一些关于Kv1.4相互作用蛋白研究的报道，但仍有很多问题有待解决。本研究通过免疫共沉淀结合质谱等技术发现突触结合蛋白Ⅰ能与突触前膜的Kv1.4蛋白形成天然复合物，表明突触结合蛋白Ⅰ是Kv1.4的相互作用蛋白。用突触结合蛋白Ⅰ特异的抗体能使Kv1.4蛋白共沉淀进一步证明了这一结论。免疫组化实验表明，突触结合蛋白Ⅰ和Kv1.4蛋白在海马的CA3区具有共定位。此外，我们利用膜片钳技术发现突触结合蛋白Ⅰ能延缓HEK293T细胞中Kv1.4的失活，但不影响其激活动力学；突触结合蛋白Ⅰ与Kv1.4的结合依赖于Ca2+的存在。实验证明突触结合蛋白Ⅰ是Kv1.4内在的辅助亚基，它们之间的物理和功能互作可能在突触效率和神经元兴奋中起一定作用。上述研究结果给神经传递调节机制的阐明提供了新的线索。