一种黑曲霉菌株及其在果胶酶固态发酵生产中的应用

摘要

本发明涉及一种黑曲霉菌株及其在固态发酵生产中的应用，其黑曲霉菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC.NO.1100；本发明的微生物菌株可用于果胶酶的固态发酵生产中培养本发明黑曲霉F02菌株(Aspergillus niger F02)的营养源有碳源、氮源、无机盐和微量营养物；采用本发明菌株生产原料主要是麦麸、米糠和面粉等农副产品，故投资少、操作方便；以单位体积计算，固态发酵果胶酶的活力要比液态发酵高5－6倍。

说明书

技术领域

本发明涉及一种黑曲霉菌株及其在果胶酶固态发酵生产中的应用。

背景技术

近几十年来，我国人民生活水平不断提高，对肉、禽的需求量也在逐年上升。如何满足这一需求是畜牧业界所要解决的问题，饲料是畜禽的食物，提高饲料的利用率和动物的生长性能，在保护环境的前题下保障农牧业的持续、健康、稳定发展，已成为人类迫切需要解决的重要问题。

由微生物发酵生产的饲料，其所用酶制剂是无毒、无污染残留的绿色饲料添加剂，在饲料中添加适量的与饲料日粮相匹配的酶制剂能明显提高饲料利用率，减少对环境的污染。

果胶酶是用于饲料的重要酶制剂，能明显提高饲料的消化利用率，同时还可以减少畜禽水产的死亡率。在动物饲养早期还能起到替代金霉素的作用。但是至今还没有一种用于果胶酶制备的优良的微生物菌株。目前工业上用于果胶酶制备的微生物菌株，在1993年以前，关于高产果胶酶的黑曲霉研究报道很多，但是发酵酶活力上升有限，最高值在1270单位/克左右；近几年的报道中，一种塔宾曲霉产果胶酶也仅为3200单位/克左右，另一种黑曲霉产果胶酶为6000单位/克左右。因此工业上迫切需要一种可高产果胶酶的微生物新菌株并将其在发酵中应用。

发明内容

本发明的目的在于改进现有技术之缺点而提供一种可高产果胶酶的黑曲霉菌株。

本发明的另一目的在于提供一种所述黑曲霉菌株在果胶酶固态发酵生产中的应用。

为实现上述提供一种可高产果胶酶的微生物菌株的目的，本发明采取下述设计方案，申请人从发霉桔子皮中分离出一株霉菌，以此作为出发菌株，采用诱变剂处理菌体细胞，获得了本发明可高产果胶酶的黑曲霉新菌株。具体诱变选育过程如下：

1、出发菌的筛选

从桔皮中取样制成浓度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌悬液，接种在固体马铃薯琼脂培养基上，保持30～32℃恒温培养4天，在10^-4稀释度的琼脂平板上分离获得一株曲霉，以此为出发株，进行后续的诱变选育。所述固体马铃薯琼脂培养基配方及制作：去皮马铃薯200～300克、葡萄糖15～20克、琼脂15～20克、蒸溜水1000毫升、青霉素3～6ppm，pH值5.5～6.0，121℃高压灭菌15～20分钟。

2、诱变选育

对上述出发菌进行诱变筛选和摇瓶培养，测定分析其产酶能力，主要分析指标是果胶酶。

诱变选育过程按下述流程进行：

出发菌株→紫外诱变→γ射线诱变→NTG处理孢子→挑选单菌落。

所述NTG是指N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍

菌落的筛选和产酶性能测定依据下述方法：

挑选40～60个单菌落，做摇管试验，测定产酶能力，选择2～3株，摇瓶试验最后选择一株。

紫外诱变：紫外线的功率为15瓦，照射距离为20～30厘米，照射时间为10分钟，用无菌生理盐水制备孢子菌悬液，菌悬液的孢子数在10⁶～10⁷个/毫升，液层的厚度为0.4～0.6厘米，照射后在增菌培养液中静息培养8～12小时，然后稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在30～32℃恒温培养4天，挑选单菌落，用于下一步诱变；

γ射线诱变：γ射线来源于钴60，待处理菌悬液的孢子数在10⁵～10⁶个/毫升，照射剂量为600～800居里，诱变后立即稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在30～32℃下恒温培养4天，挑选单菌落，用于下一步诱变；

NTG处理孢子；NTG药物诱变剂的浓度为200～300ppm，待处理菌悬液的孢子数在10⁵～10⁶个/毫升，作用时间为20～30分钟，作用温度为28～35℃，诱变后在增菌培养液中静息培养6～10小时，然后稀释涂布在马铃薯固体琼脂培养基上，在30～32℃下恒温培养4天，挑选单菌落用于下一步诱变；

复合诱变：以上述第一轮循环获得的菌落作为出发菌，再次进行复合诱变、筛选，如此重复3次，最终获得可高产果胶酶的突变菌株数10株，其中优选的是菌株F02，其固态发酵干曲的果胶酶活力为1800单位/克(pH值为3.5)。

固体斜面培养基配方：NaNO₃0.2～0.4％、KCL0.04～0.06％、KH₂PO₄0.09～0.11％、FeSO₄0.001～0.002％、MgSO₄0.04～0.06％、蔗糖2.5～3.5％、琼脂1.8～2.0％，pH值6.6～6.8，培养温度为28～30℃，培养时间5～6天，孢子呈黑色，斜面菌种在4℃条件下保藏，6个月转接一次。

增菌培养液配方：NaNO₃ 0.2～0.4％、KCL 0.04～0.06％、KH₂PO₄ 0.09～0.11％、FeSO₄ 0.001～0.002％、MgSO₄ 0.04～0.06％、蔗糖2.5～3.5％，pH值6.6～6.8。

按照中国专利法及其实施细则的规定，本发明的黑曲霉(Aspergillusniger)F02新菌株已于2004年3月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为NO.1100。

本发明进行果胶酶活力的测定(pH3.5)中采用了以下方法：

1、酶活定义

在实验条件下，每小时内从底物溶液中分解释放1毫克还原物质(表述为半乳糖醛酸)所需要的酶量为一个酶活单位。

2、试剂

[缓冲液]

称取三水乙酸钠2克(精确至0.01克)，加入冰乙酸10.6毫升(精确至0.01毫升)。再加水溶解，定容至1000毫升。测定溶液的pH值，如果pH值偏离3.5，在用0.1毫升/升的乙酸钠溶液调节至3.5。

[底物溶液]

称取1.00克果胶(Fluka76280或SigmaP9135)，用pH3.5的缓冲溶液溶解，磁力搅拌2小时，定容至100毫升。储藏在4℃冰箱内，有效期2天。

[DNS试剂]

用400毫升蒸馏水溶解3.15克3，5-二硝基水杨酸，逐步加入200毫升NaOH溶液(含20克NaOH)，同时不断搅拌。温水浴(不超过48℃)同时不断搅拌，直到溶液透明清澈。再逐步加入91克四水酒石酸钾钠、2.5克苯酚和2.5克无水亚硫酸钠，同时不断搅拌。温水浴(不超过48℃)，直到溶液清澈透明。用蒸馏水定容至1000毫升，用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，保存在棕色瓶中。5天后可以使用，在有效期为6个月。

3、标准曲线

制备标准一水D-半乳糖醛酸溶液。

溶解1.0克一水半乳糖醛酸，定容至100毫升，获得浓度为10毫克/毫升的半乳糖醛酸溶液。然后用缓冲液作系列稀释，配制浓度为0.1毫克/毫升、0.2毫克/毫升、0.3毫克/毫升、0.4毫克/毫升、0.5毫克/毫升、0.6毫克/毫升和0.7毫克/毫升的标准溶液。吸取2.0毫升标准溶液和2.0毫升蒸馏水，加入到试管中，震荡，加入4毫升DNS试剂，震荡、蒸煮5分钟。然后迅速自来水冷却。再用蒸馏水定容至20毫升。震荡摇匀，用Whatman 6号滤纸过滤。取滤渡，以浓度为0的反应液(标准空白样)作为基准，调零。在540nm处测定吸光度。测定值做2个重复，取平均值。每次更换DNS试剂，标准曲线需要重新绘制。

4、酶活测定

精确称取1.000克样品用缓冲液溶解酶样，稀释至适当浓度。

[酶样吸光度A_x]

吸取2.0毫升酶稀释液，加入到试管中，加入2.0毫升果胶底物溶液，在50℃平衡，震荡。在50℃2.0毫升精确水浴30分钟。加入4毫升DNS试剂混合。用帽塞盖住试管。在沸水中精确保温5分钟。然后，迅速用自来水冷却以终止反应。再用蒸馏水定容至20毫升。用Whatman6滤纸过滤或者在3000rpm条件下离心10分钟。取上清液，以标准空白样为基准，调零，在540nm处测定吸光度(吸光度在0.15～0.7之间，如果超过此范围，重新确定稀释度)。测定值做2个重复，取平均值。(重复值之前的相对误差不超过8.0％，否则得重新测定。)

[酶空白样吸光度A]

吸取2.0毫升果胶溶液，在50℃精确保温30分钟。加入4毫升DNS试剂，震荡。加入2.0毫升酶的稀释液，混合。在沸水中精确蒸煮5分钟。然后迅速用自来水冷却以终止反应。用蒸馏水定容至20毫升，用Whatman6滤纸过滤或者在3000rpm条件下离心10分钟，取上清液。以标准空白打样为基准，调零，在540nm处测定吸光度。测定值做2个重复，取平均值。

5、酶活计算

酶活A＝[A_x-A_o]×K×DF÷0.5单位/克

A_x：酶样的吸光度；

A_o：酶空白样的吸光度；

K：标准曲线的斜率；

DF：稀释倍数；

0.5：反应时间(小时)

本发明的微生物菌株可用于果胶酶的固态发酵生产中。在果胶酶的固态发酵生产中，用于本发明菌株发酵培养基没有特别限定，只要有含有必须的碳源、氮源和促生长因子的培养基，都适用于本发明的菌株。可以用于培养本发明微生物菌株的营养源有碳源、氮源、无机盐和微量营养物，其中碳源包括D-葡萄糖、D-果糖、D-山梨醇、D-甘露糖、淀粉水解糖、淀粉等；氮源包括有机氮和无机氮，有机氮如玉米浆、酵母膏、干酵母、鱼粉、肉膏、蛋白胨等，无机氮包括氨水、氨气、硫酸氨、硝酸铵、氯化铵、碳酸胺、磷酸胺等；另外，培养基中还含各种金属离子、维生素、氨基酸和微生物生长所必须的其他物质。这些成分可预先一次性加入培养基中，或者间歇或连续地加入培养基中。

对于本发明微生物菌株，可以采用如下固态发酵培养基配方：麦麸70～90％、硫酸铵3～5.0％、面粉5～10％、桔子皮粉3～5.0％、米糠3～10％。硫酸铵先溶解，然后与面粉、米糠、桔子皮粉和麦麸混合，调节pH值到6.5～7.1之间。

固态发酵过程包括消毒灭菌、接种，三角瓶恒温培养，培养温度为30～35℃。在发酵进行到30小时以后，菌体的生长速度逐渐下降，发酵产热也降低，菌体开始产生孢子，酶活开始急剧增加。发酵到48小时以后，酶活的增长速度逐渐下降，60小时以后酶活增加很少。

[有益效果]

用本发明的菌株生产的果胶酶在pH值为3.5的范围内性能稳定，酶活力(50℃)能够稳定保持在18000单位/克以上。发酵时间为60～64小时，生产成本不超过5元/公斤(干曲)。

采用本发明的菌株进行固态发酵制备果胶酶生产原料主要是麦麸、米糠和面粉等农副产品，故投资少、操作方便，以单位体积计算，固态发酵果胶酶的活力要比液态发酵高5～6倍。

具体实施方式

实施例1

取黑曲霉(Aspergillus niger)F02斜面菌种一支，加入5毫升无菌水，洗涤黑曲霉的孢子，然后吸取孢子液5毫升，接种到在由麦麸(96％)、硫酸铵(2.0％)和磷酸二氢钾(2.0％)组成的50克种子培养基(pH6.0、含水量为50％)中，30℃培养48小时后，接入由麦麸(80％)、硫酸铵(2.0％)面粉(5.0％)、米糠(5.0％)、桔皮粉(3％)组成的2公斤固态培养基(pH6.8，含水量为60％)中。在28℃下培养58小时，培养基中果胶酶活力达到17000单位/克。

实施例2

取黑曲霉(Aspergillus niger)F02斜面菌种一支，加入10毫升无菌水，洗涤黑曲霉的孢子，然后吸取孢子液5毫升，接种到在由麦麸(96％)、硫酸铵(2.0％)和磷酸二氢钾(2.0％)组成的50克种子培养基(pH6.0、含水量为50％)中，30℃培养48小时后，接入由麦麸(80％)、硫酸铵(2.0％)面粉(5.0％)、米糠(5.0％)、桔皮粉(3％)组成的2公斤固态培养基(pH6.7，含水量为60％)中。在28℃下培养60小时，培养基中果胶酶活力达到18000单位/克。

实施例3

取黑曲霉(Aspergillus niger)F02斜面菌种一支，加入5毫升无菌水，洗涤黑曲霉的孢子，然后吸取孢子液3毫升，接种到在由麦麸(80％)、硫酸铵(2.0％)、面粉(5.0％)、米糠(5.0％)、桔皮粉(3％)组成的20克固态培养基(pH6.8，含水量为60％)中，培养基装在250毫升三角瓶中30℃培养62小时后，培养基中果胶酶活力达到16000单位/克。