酵母细胞转化葡萄糖制备阿拉伯糖醇的方法

摘要

一种通过培养酵母细胞,再用酵母细胞转化D－葡萄糖制备D－阿拉伯糖醇的方法,对葡萄糖的转化率可达55-60%。这种方法与发酵法相比,有设备简单、操作粗放、提取方便等特点,具有实际应用价值。

说明书

本发明属于生物化工领域，具体地说是指利用微生物细胞转化的方法，建立一种制糖醇的新工艺。

本发明涉及利用酵母细胞建立D-阿拉伯糖醇(以下简称阿拉伯糖醇)的制备方法。

(1)．阿拉伯糖醇是白色晶体，有甜味，旋光度130°，熔点103℃，应用于食品、轻工等方面。它是一种五碳多元醇，化学结构为：

通过酵母菌发酵D-葡萄糖(以下简称葡萄糖)可以制备阿拉伯糖醇(张树政等：微生物学报，9(2)：134-139，1963)，转化率为30％～40％。但是发酵法存在以下一些问题：

一、发酵时间较长，在整个发酵过程中均需保持无菌操作，因此对设备和操作条件均有较高要求，从而增加了设备投资与操作费用。

二、发酵液成分复杂，给后处理带来困难，使工艺复杂化，不仅成本提高，而且影响产品质量。

这些问题影响了发酵法的实际应用。

我们选育了一株酵母菌(异常汉逊酵母Hansenula anomala)，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册的编号为CGMCC0274(专利申请号No.96120000.6)。将上述酵母菌接种于培养基(1％木糖，0.5％酵母提取物，1％蛋白胨)中，培养温度可以在22-37℃范围内，最佳培养温度为30℃，培养时间可在6-48小时的范围内，较佳培养时间为14-36小时，离心收集细胞，洗涤后将细胞重悬于葡萄糖溶液中，葡萄糖溶液浓度范围为2-45％，30℃转化120小时，葡萄糖全部转化为阿拉伯糖醇，摩尔转化率55-60％。转化液经分离细胞、脱色、浓缩、结晶，得到阿拉伯糖醇。

本发明采用的细胞转化法，仅在细胞培养阶段需保持无菌操作，其时间不到发酵法的五分之一。转化反应设备与操作要求低，反应液成分单一，只有底物葡萄糖，产物易于分离纯化。因此转化法避免了发酵法存在的问题，具有实际应用价值。

实施例：实施例1：以纯木糖为碳源培养酵母细胞将所用酵母菌接一环于液体培养基(D-木糖1％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，pH5.0，20ml培养基/250ml三角瓶)中，在温度为30℃，220rpm摇床上培养36小时后，离心收集菌体(BECKMAN GS-15R，F0630，8000rpm，10℃，10分钟)，菌体用10ml蒸馏水洗涤两次。

用20ml蒸馏水悬浮菌体，将菌体转入250ml三角瓶中，称取2克D-葡萄糖置于上述三角瓶中，用纱布封住瓶口，于30℃在250rpm旋转摇床上进行转化，96小时后反应终止，用HPLC测定葡萄糖和阿拉伯糖醇的浓度，计算反应摩尔转化率为54％。实施例2：以纯木糖和葡萄糖为碳源培养酵母细胞接所用酵母菌一环于液体摇瓶培养基(D-木糖1％，葡萄糖1％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，pH5.0，50ml培养基/500ml三角瓶)中，在温度为30℃，250rpm摇床上培养24小时后，离心收集菌体(BECKMAN GS-15R，F0630，8000rpm，10℃，10分钟)，菌体用20ml生理盐水洗涤两次。

用50ml蒸馏水悬浮菌体，将菌体转入500ml三角瓶中，称取7克D-葡萄糖置于上述三角瓶中，用纱布封住瓶口，于28℃在250rpm旋转摇床上进行转化，108小时后反应终止，用HPLC测定葡萄糖和阿拉伯糖醇的浓度，计算反应摩尔转化率为58％。实施例3：以半纤维素水解液为碳源培养酵母细胞

称取50克木屑或玉米芯或蔗渣，加入2％硫酸溶液至500ml体积，115℃保温小时进行水解，用Ca(OH)₂中和水解物至pH7.0，充分析出硫酸钙后除去沉淀，再用离子交换树脂除去水解液中的离子，即得水解液，其中D-木糖含量为1.5％，D-葡萄糖含量为0.15％。

用上述水解液配置培养酵母菌的培养基，在30ml培养基中含20ml水解液，10ml水，0.3克蛋白胨，0.15克酵母膏，pH调至5.0，装在250ml三角瓶中，灭菌后接一环所用的酵母菌在温度为30℃，220rpm摇床上培养30小时后，离心收集菌体(BECKMAN GS-15R，F0630，8000rpm，10℃，10分钟)，用蒸馏水10ml洗涤菌体两次，离心取菌体。

用20ml蒸馏水悬浮菌体，将菌体转入250ml三角瓶中，称取3克D-葡萄糖置于上述三角瓶中，用纱布封住瓶口，于旋转摇床上进行转化(温度35℃，250rpm)，108小时后反应终止，用HPLC测定葡萄糖和阿拉伯糖醇的浓度，计算反应转化率为55％。实施例4：发酵罐培养细胞后进行罐中转化

在8瓶培养基(25ml培养基/250ml三角瓶，木糖1％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，pH5.0)中接入所用酵母菌，于30℃，220rpm摇床培养16小时，共计200ml培养物作为液体种子。

用实施例3中水解液配发酵罐培养基，在4L培养基中含2.7L水解液，1.3L自来水，20克酵母膏，40克蛋白胨，将培养基置于6.6L NBSBioFloⅢ自控发酵罐中，灭菌后接入前述200ml液体种子进行菌体培养(500rpm搅拌，2L/分钟通气，温度30℃，pH小于5.0)，14小时后离心收获菌体，菌体用自来水洗涤两次。

用4L 5％的葡萄糖溶液悬浮菌体，加入自控罐中进行转化反应(溶氧控制60％，温度30℃)。在反应过程中不断加入固体葡萄糖，以维持残糖浓度为5％，至144小时时共补加400克葡萄糖，反应至216小时时残糖耗尽，测定阿拉伯糖醇的浓度，计算转化率为60％。

本发明所涉及的利用微生物细胞转化制备阿拉伯糖醇所述的各实施例，其D-阿拉伯糖醇的提取方法都可按下列步骤进行：

将以上实施例中的反应液离心除去菌体后，加热煮沸20分钟，调pH至2-3，加3％活性炭，80℃保温1小时，过滤除去活性炭，滤液通过截留分子量为6000的超滤膜进一步澄清。

将得到的清液在55℃减压浓缩至D-阿拉伯糖醇浓度为80％，缓慢降温并缓慢搅拌至形成结晶，待结晶充分后，抽滤得到晶体D-阿拉伯糖醇。烘干后检测其旋光度为131.6°，熔点为99.5-101.3℃。与标准品一致。