卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物载体及其应用

摘要

本发明公开了一种卡拉胶—魔芋多糖复配胶固定化微生物载体,以及该载体在制备核苷三磷酸如腺苷三磷酸(ATP)、乌苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)和尿苷三磷酸(UTP)等生产过程中的应用。具有固定化微生物强度高、弹性好、不易破碎、有利于长期反复使用、不易被微生物分解、底物转化率高和产品纯度高等优点。

说明书

本发明属于生物化学工程技术领域，涉及一种固定化微生物的载体及其应用，尤其涉及一种卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物的载体，以及该固定化微生物载体在制备核苷三磷酸如腺苷三磷酸(ATP)、乌苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)和尿苷三磷酸(UTP)等生产过程中的应用。

核苷三磷酸是生物体内高能化合物，可作为生化药物治疗肌肉萎缩和心脏疾患等疾病，胞苷三磷酸(CTP)还能治疗脑震荡、脑外伤和严重神经衰弱等，另外，核苷三磷酸还是一种重要的生化试剂。用固定化微生物制备核苷三磷酸是70年代才开始的一项新的生产技术。中国专利ZL 92113813.X公开了一种用明胶戊二醛固定化酵母生产腺苷三磷酸(ATP)的方法，该方法虽具有固定化物可反复使用、分离提取简单和产品纯度高等优点，但由于明胶是一种蛋白质，易为微生物中的蛋白酶所降解，故而当其受到杂菌污染或长期使用后，固定化颗粒强度和比重会降低，将会增加操作难度和影响使用寿命。

日本发酵工学1978年56卷第5期枥仓报道了一种利用干面包酵母制造核苷三磷酸的方法，但其腺苷三磷酸(ATP)的转化率仅为53％，胞苷三磷酸(CTP)的转化率仅为88％，尿苷三磷酸(UTP)的转化率仅为85％，而且反应时间长达7小时，酵母不能反复使用，产品的分离也有一定的困难。

本发明的目的在于公开一种卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物载体，以及该载体在制备核苷三磷酸如腺苷三磷酸(ATP)、乌苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)和尿苷三磷酸(UTP)等生产过程中的应用。

本发明的构思是这样的：

发明人针对单独用卡拉胶固定化微生物时，存在着凝胶强度低，脆性和泌水性，颗粒容易破碎等缺陷，采用卡拉胶钠盐与魔芋多糖的复配胶作为固定化微生物的载体，将微生物包埋在卡拉胶钠盐与魔芋多糖的复配胶中，组成一种卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物。魔芋多糖的主要成分为葡萄甘露聚糖，它是D-葡萄糖和D-甘露聚糖按一定比例，以β-1,4糖苷键结合的复合多糖，试验证明：卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物不但具有明胶戊二醛固定化微生物的优点，而且能避免单独使用卡拉胶时的缺点。

本发明所说的卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物载体为一个组合物，其组分和含量如下：κ-卡拉胶钠盐    2～10％魔芋多糖         0.4～4％水               余量优选的比例为：    κ-卡拉胶钠盐    3～6％魔芋多糖         0.6～1.8％水               余量最佳的比例为：κ-卡拉胶钠盐    3.2％魔芋多糖         0.8％水               余量上述组分的含量均重量百分比。

所说的κ-卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物载体的制备过程是十分简单的，将κ-卡拉胶钠盐和魔芋多糖精粉按上述比例溶解于水中，即可获得所说的载体，该载体可在40～50的温度下保温备用。

所说的κ-卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物载体可用于包埋各种微生物，如酵母、黄色短杆菌、枯草杆菌或大肠杆菌等，从而获得κ-卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物。其制备过程主要包括以下步骤：

(1)将微生物(含水量80％，活菌数90％)用生理盐水洗涤，并在30～40℃的温度下保温20～40分，然后倒入上述热的卡拉胶钠盐魔芋多糖精粉的混合物中，搅拌均匀，倒入盘中铺成2～4mm的膜。微生物的加入量为总重量的45～55％；

(2)加入浓度为0.3％～2％(wt％)的凝固剂-KCl溶液，加入量为含有微生物的混合物总量的0.15～1％，再置于4～20℃的环境中，使其凝固，将其均匀切割成小块；

(3)将小块投入浓度为0.3％～2％(wt％)的凝固剂-KCl溶液中浸泡，使其充分凝固，然后再投入浓度为0.5％～2％(wt％)的戊二醛溶液中浸泡20～60分钟进行交联加固，即可获得卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化微生物，将其置于-15--30℃的环境中保存备用；

当微生物为酵母时，则可用于制备核苷三磷酸，如腺苷三磷酸(ATP)、乌苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)和尿苷三磷酸(UTP)。制备过程如下：

将所说的卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化酵母与反应液按置于反应器中，震荡反应，反应结束后，将反应产物离心过滤，滤液用717阴离子交换树脂进行处理，吸附其中的核苷三磷酸，然后用0.7mol/L的(pH=2)NaCl洗脱，收集洗脱液，加入乙醇，使核苷三磷酸沉淀，经过滤和真空干燥后可得目标产物-核苷三磷酸。固定化酵母则可再次重复使用。

所说的反应液为一个组合物，其摩尔组成比为：底物        20～80        mmol/L葡萄糖      100～300      mmol/L硫酸镁      4～20         mmol/L磷酸缓冲液  150～350      mmol/L(pH=6.5～7.5)辅酶Ⅰ      0～3          mmol/L水          余量；

卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化酵母与反应液之比为1(克)∶(0.7～1.5)(ml)；

优选的酶促反应温度为26～38℃，最佳的温度为36℃，反应时间为1～4小时，优选的反应时间为2～3小时。

所说的底物为腺苷(AR)、腺苷酸(AMP)、乌苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)或尿苷酸(UMP)中的一种；

当底物为腺苷(AR)或腺苷酸(AMP)时，可获得腺苷三磷酸(ATP)；当底物为乌苷酸(GMP)时，可获得乌苷三磷酸(GTP)；当底物为胞苷酸(CMP)时，可获得胞苷三磷酸(CTP)；当底物为尿苷酸(UMP)时，可获得尿苷三磷酸(UTP)。

所说的辅酶Ⅰ为腺嘌呤酰胺二核苷酸。

以下将结合实施例对本发明所说的内容作进一步的说明。

实施例1

将8克κ-卡拉胶钠盐和2克魔芋多糖精粉溶解于250ml水中，在50℃的温度下保温备用，将250克的啤酒酵母(含水量80％，活菌数90％)用生理盐水洗涤，并在36℃的温度下保温30分钟，然后倒入上述热的卡拉胶钠盐魔芋多糖精粉的混合物中，搅拌均匀，倒入盘中铺成2mm的膜，加入500ml浓度为0.3％(wt％)的KCl溶液，再置于4℃的环境中，使其凝固，将其均匀切割成小块后投入浓度为0.3％(wt％)的KCl溶液中浸泡，使其充分凝固，然后再投入浓度为0.5％(wt％)的戊二醛溶液中浸泡30分钟，进行交联加固，即可获得卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化酵母，将其置于-20℃的环境中保存备用。经测定，其各项机械性能均优于同类载体，结果如下所示：

    卡拉胶    海藻酸钠    复配胶凝胶密度(g/cm²)    1008    1530    2020弹性    +     +++    +++

                     实施例2

称取实施例1所制备的κ-卡拉胶-魔芋多糖复配胶固定化酵母15克置于反应瓶中，加入AR 40mmol，葡萄糖250mmol，硫酸镁8mmol，磷酸缓冲液250mmol(pH=6.5～7.5)，辅酶Ⅰ 1mmol，在36℃下震荡反应2小时，用HPCC法或电泳法对反应液进行分析，产物-ATP的转化率为99％。反应结束后，将反应产物离心过滤，滤液用717阴离子交换树脂进行处理，吸附其中的核苷三磷酸，然后用0.7mol/L的(pH2)NaCl洗脱，收集洗脱液，加入乙醇，使核苷三磷酸沉淀，经过滤和真空干燥后可得目标产物-核苷三磷酸。

                   实施例3～6

操作过程与实施例2相同，将底物分别用AMP、GMP、CMP和VMP取代，其产物分别为ATP、GTP、CTP和UTP，其转化率分别为90％、96％、98％和98％。

由上述公开的技术方案和实施例可见，本发明的优点是十分明显的：

(1)固定化微生物强度高，弹性好，不易破碎，有利于长期反复使用；

(2)κ-卡拉胶-魔芋多糖复配胶不易被微生物分解；

(3)底物转化率高，最高可达99％；

(4)固定化微生物可多次重复使用，生产成本低。

(5)固定化微生物与产物容易分离，微生物留存在包埋颗粒中，不带入反应溶液中，简化了分离工序，并可获得高品质的产品。