TOLL-样受体和激动剂用于治疗癌症的用途

摘要

本发明涉及通过提供toll-样受体诸如toll-样受体5(TLR-5)并联合提供toll-样受体激动剂诸如鞭毛蛋白用于治疗癌症或传染病的方法和药剂，其产生顺位效应和反位效应，该效应可募集参与先天性（顺位效应）和适应性（反位效应）免疫应答的细胞，从而经NF-κB凋亡途径特异性杀死癌细胞以及感染病原体的细胞。

说明书

技术领域

本发明涉及治疗癌症和传染病的方法。

背景技术

Toll-样受体负责识别细菌和病毒病原体的最常见模式。其激活导 致先天性免疫应答以及随后的适应性免疫应答的募集。针对抗原存在 部位的免疫系统的受体细胞是有效免疫应答中的关键步骤。这即是为 何免疫参与不同类型佐剂的缘由。尽管大多数肿瘤表达肿瘤特异性抗 原，但是它们正利用很多机制，以允许其逃避免疫识别。最近在小鼠 模型中证明，通过TLR5配体和激动剂即细菌鞭毛蛋白来激活TLR5 可对那些表达功能性TLR5的肿瘤引发抗肿瘤作用。这为考虑将TLR5 激动剂用于癌症免疫疗法开启了一个常规机会。在将该概念还原到实 践的途中存在两个主要障碍。第一，表达功能性TLR5的肿瘤的罕见 发生率将该方法的适用性仅局限于少数肿瘤亚组。第二，全身性施用 TLR5激动剂导致TRL5信号传导在所有细胞中激活，这些细胞含有进 行未集中且非肿瘤特异性应答的功能性受体。因此，在现有技术中需 要自分泌激活感染细胞或肿瘤细胞中的TLR受体信号传导且具有最低 限度的全身作用从而能够引发特异性针对该感染细胞或肿瘤的先天性 免疫应答的机制或方法。

发明内容

本发明可涉及载体，其包含第一核酸和第二核酸，其中所述第一 核酸编码Toll-样受体，而所述第二核酸编码Toll-样受体激动剂。所述 第一核酸可以编码Toll-样受体的分泌形式。所述第二核酸可以是鞭毛 蛋白的分泌形式。所述Toll-样受体激动剂可以是鞭毛蛋白。所述载体 可以是哺乳动物表达载体。所述载体可以从腺病毒、慢病毒或脂质体 表达。鞭毛蛋白的分泌形式可以是CBLB502S。Toll-样受体可以是 TLR-5。

本发明可涉及在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括向需要其的哺 乳动物施用包含含第一和第二核酸的载体的药剂，其中所述第一核酸 编码Toll-样受体，而所述第二核酸编码Toll-样受体激动剂。所述癌症 可以是肿瘤。所述肿瘤可以源于前列腺、乳腺、结肠、食道、胃、肺、 胰脏、肾、甲状腺、卵巢、咽喉或子宫颈。所述肿瘤可以源于肉瘤、 黑素瘤、白血病和淋巴瘤。所述药剂可以从哺乳动物的肿瘤反位施用 或者外部施用。所述药剂可以被直接施用到哺乳动物的肿瘤中。所述 药剂可以与免疫刺激剂联合施用。所述免疫刺激剂可以选自生长激素、 促乳素和维生素D。所述生长激素可以是促生长素。所述药剂可与细 胞因子联合施用。所述细胞因子可以是干细胞因子。

本发明还涉及在哺乳动物中治疗感染的方法，包括向需要其的哺 乳动物施用包含含第一和第二核酸的载体的药剂，其中所述第一核酸 编码Toll-样受体，而所述第二核酸编码Toll-样受体激动剂。所述癌症 可以是肿瘤。所述感染可以源于病毒、细菌、原生动物寄生虫（protozoan parasites）和真菌。

附图简述

图1A-1C描绘了表达TLR5、CBLB502S及其组合(TLR5+ CBLB502S)的腺病毒载体的示意图。

图2描绘了在小鼠中，在用对照载体(无TLR5)或表达TLR5的载 体转导的肿瘤细胞(A549)中多天内肿瘤体积比率的结果，其中小鼠用 CBLB502或PBS处理三天。

图3描绘了通过注射包含共表达CBLB502S和Toll-样受体的载体 的腺病毒引发的肿瘤生长抑制，其中该腺病毒被注射进同基因小鼠 CT26结肠癌肿瘤中，并研究该腺病毒载体构建物的顺位和反位效应。

图4显示了细菌鞭毛蛋白的域结构。Ca骨架痕迹、疏水核分布和 F41的结构信息。定义了结构域D1、D2a、D2b和D3的四种不同疏水 核。所有疏水侧链原子显示有Ca骨架。侧链原子用颜色编码：Ala， 黄色；Leu、He或Val，橙色；Phe和Tyr，紫色(碳原子)和红色(氧原 子)。鞭毛蛋白的氨基酸序列中的c位和多种结构特征的区域。从上到 下显示的是：F41片段，蓝色；三个b-叶折叠（folium folds），褐色； 含a-螺旋的二级结构分布，黄色，b-结构，绿色，以及b-转角，紫色； 每50个残基的tic标记，蓝色；结构域D1、D2a、D2b和D3；第一 元件（proto-element）内的轴亚单位接触区域，蓝绿色；充分保守的氨 基酸序列，红色，以及可变区，紫色；F41中产生不同超卷曲元件的 点突变。底部的字母表示突变元件的形态学：L(D107E,R124A,R124S, G426A),L-型直链；R(A449V),R-型直链；C(D313Y,A414V,A427V, N433D),卷曲33。

图5显示了沙门氏菌鞭毛蛋白结构域、其片段以及其余TLR5相 互作用的示意图。深色条形（Dark bars）表示用于构建含A、B、C、 A'和B'的片段的鞭毛蛋白基因的区域。

图6描述了鞭毛蛋白衍生物。已选鞭毛蛋白衍生物（列于右侧） 的域结构和近似边界(氨基酸坐标)。都柏林沙门氏菌的FliC鞭毛蛋白 在505个氨基酸(aa)内被编码。

图7显示了下述鞭毛蛋白变体的核苷酸和氨基酸序列：AA'(SEQ ID NO:7-8)、AB'(SEQ ID NO:9-10)、BA'(SEQ ID NO:11-12)、BB'(SEQ ID NO:13-14)、CA'(SEQ ID NO:15-16)、CB'(SEQ ID NO:17-18)、A (SEQ ID NO:19-20)、B(SEQ ID NO:21-22)、C(SEQ ID NO:23-24)、 GST-A'(SEQ ID NO:25-26)、GST-B'(SEQ ID NO:27-28)、AA'nl-170 (SEQ ID NO:29-30)、AA'nl-163(SEQ ID NO:33-34)、AA'n54-170(SEQ ID NO:31-32)、AA'n54-163(SEQ ID NO:335-36)、AB'nl-170(SEQ ID NO:37-38)、AB'nl-163(SEQ ID NO:39-40)、AA'nl-129(SEQ ID NO: 41-42)、AA'n54-129(SEQ ID NO:43-44)、AB'nl-129(SEQ ID NO: 45-46)、AB'n54-129(SEQ ID NO:47-48)、AA'nl-100(SEQ ID NO: 49-50)、AB'nl-100(SEQ ID NO:51-52)、AA'nl-70(SEQ ID NO:53-54) 和AB'nl-70(SEQ ID NO:55-56)。pRSETb前导序列以斜体显示(前导 包括Met，其还是FliC的氨基酸1)。N端恒定区有下划线。氨基酸连 接序列是粗体。C端恒定区有下划线。GST如果存在的话被突出显示。

图8显示了来自21种细菌的保守氨基(图8A)和羧基(图8B)端的氨 基酸序列的对比。对于TLR5活性而言重要的13个保守氨基酸以阴影 显示。氨基酸通过其来自TrEMBL(首字母=Q)或Swiss-Prot(首字母=P) 的登记号来鉴定。

图9显示了人类Toll-样受体5蛋白质的核酸和氨基酸序列。

发明详述

本发明得到惊人的发现，即Toll-样受体诸如Toll-样受体5(TLR-5) 联合Toll-样受体激动剂诸如鞭毛蛋白的提供导致顺位和反位效应，该 效应募集参与先天性（顺位效应）和适应性（反位效应）免疫应答的 细胞，从而经NF-[κ]B凋亡途径特异性杀死癌细胞以及感染病原体的 细胞。尽管不受理论束缚，但是在本发明中所实施的概念旨在：(i)通 过用驱动TLR表达的构建物转导肿瘤，克服TLR-介导的免疫策略对 该肿瘤中已有的TLR表达的依赖性；和(ii)通过建立TLR激动剂的地 址池（local pool）指挥对肿瘤的免疫应答。例如，含TLR的药物制剂 同时诱导表达并激活TLR，从而使肿瘤细胞暴露于宿主免疫系统，该 宿主系统模拟大量细菌穿透肠壁的情况。

通过提供TLR诸如TLR5和TLR激动剂诸如鞭毛蛋白，以互相影 响并激活先天性和适应性免疫系统二者，所述方法可用于治疗源于前 列腺癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、肺癌、胰脏癌、肾癌、甲 状腺癌、卵巢癌、咽喉癌或子宫颈癌的癌症以及治疗肉瘤、黑素瘤、 白血病和淋巴瘤。该方法的应用不限于癌症治疗，因为该方法还可用 于治疗源自病毒、细菌、原生动物寄生虫和真菌的感染。

提供TLR和TLR激动剂的变化方式可包括载体，其共表达TLR 受体和在同一受损哺乳动物细胞中激活TLR活性的鞭毛蛋白的可分泌 形式。本发明的方法还可以包括载体构建物，其表达哺乳动物细胞中 的TLR受体以及被反位施用于该细胞的TLR激动剂。例如，腺病毒载 体可能要求修饰鞭毛蛋白以实现其有效合成和被哺乳动物细胞分泌。

1.定义

本文试验的术语目的是仅描述特定实施方式，而非意图是限定性 的。如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个（a， an）”和“该（the）”包括复数指代，除非上下文有明确地另有所指

对于本文中数值范围的描述，每个介于中间的数字以相同程度的 精确度明确考虑在内。例如，对于6-9的范围而言，除6和9之外， 数字7和8考虑在内，而对于范围6.0-7.0来说，数字6.0、6.1、6.2、 6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0明确考虑在内。

"施用"可指单次剂量或多剂量的药剂或试剂。

在肽或多肽的上下文中，"类似物"可指下述肽或多肽：其包含一 个或更多个非标准氨基酸或源自常规氨基酸集合的其他结构变异。

"抗体"可指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE种类的抗体或其片段或 衍生物，包括ab、F(ab')2，Fd，以及单链抗体、二抗体（diabodies）、 双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是单克隆抗体、多 克隆抗体、亲和力纯化抗体（affinity purified antibody）或其混合物， 所述抗体对所需表位或源自其中的序列表现出足够的结合特异性。抗 体还可以是嵌合抗体。抗体可以提供连接一个或更多个本领域已知的 化学部分、肽部分或多肽部分而被衍生化。抗体可以与化学部分结合。

"衍生物"可指除在一级结构外不同的肽或多肽(氨基酸和氨基酸类 似物)。衍生物可由于糖基化而不同，糖基化是一种翻译后修饰形式。 例如，肽或多肽由于在异源系统中表达而展示糖基化模式。如果至少 一种生物活性被保留，那么根据本发明这些肽或多肽是衍生物。其他 衍生物可包括具有共价修饰N-或C-端的融合肽或融合多肽、聚乙二醇 化肽或多肽、与脂质部分相连的肽或多肽、烷基化肽或多肽、经由氨 基酸侧链官能团与其他肽、多肽或化学品连接的肽或多肽，以及本领 域应知晓的其他修饰。

"片段"可以是参考肽或多肽的一部分。

"同系物"可以指共享一个共同进化祖先的肽或多肽。

"前导序列"可以是编码任意肽序列的核酸，其与目标肽或多肽连 接并被其翻译，以使该目标肽或多肽被适当地发送经过真核细胞的内 质网和高尔基复合体，目的是自细胞膜的胞外分泌。前导序列可以衍 生自碱性磷酸酶。前导序列可以具有包含 atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctct ccctgggc的DNA序列。

"脂质体"可以指由与细胞膜相同的材料制造的小泡(囊泡)。脂质体 可以用药物填充并用于递送癌症和其他疾病用药物。脂质体可以用载 体填充。脂质体膜可以由磷脂制造，磷脂是具有头基和尾基的分子。 脂质体的头可以连接于水，而其尾由长烃链制成，被水排斥。尾部被 水排斥并排成一行而形成远离水的表面。细胞质膜中的脂质主要是磷 脂，如磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。脂质体可以由具有混合脂质链(如卵磷 脂酰乙醇胺)的天然衍生的磷脂组成或由纯表面活性剂成分如DOPE (二油酰磷脂酰乙醇胺)组成。

"肽"或"多肽"可指连接的氨基酸序列或者其可以是天然的、合成 的或者修饰的，或者天然与合成的组合。

"基本相同"可指第一和第二氨基酸序列在10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、 300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个氨基酸的区域内 是至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%相同。

"治疗(Treating、treatment)"或"为治疗（to treat)"每个可指在临时或 永久基础上减轻、抑制、压制、消除、预防或减慢状况或病症的症状、 临床迹象或潜在病理学的出现。预防状况或病症包括在疾病发作之前 向对象试验本发明的药剂。抑制状况或病症包括在该状况或病症引发 之后但是在其临床出现之前向对象试验本发明的药剂。压制状况或病 症包括在疾病临床出现之后向对象施用本发明的药剂。

"变体"可指通过氨基酸的插入、缺失或保守置换而在氨基酸序列 上不同但是保留至少一种生物活性的肽或多肽。"生物活性"的代表性 实例包括与Toll-样受体结合的能力以及被特定抗体结合的能力。变体 还可指含有与参考蛋白基本相同的氨基酸序列的蛋白质，该参考蛋白 含有保留了至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸序列的保守置换， 即用类似性质的不同氨基酸替换某种氨基酸(例如，亲水性、带电区的 程度和分布)在本领域被认为通常涉及较小变化。这些较小变化部分可 通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域应理解的。Kyte等,J.Mol. Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和电荷的 考虑。在本领域已知的是类似亲水指数的氨基酸可被置换，而且其仍 保留蛋白质功能。在一方面，亲水指数为+2的氨基酸被置换。氨基酸 的疏水性也可用于显示会产生保留生物功能的蛋白质的置换。在肽的 背景下对氨基酸亲水性的考虑使得可计算该种肽的最大程度局部平均 亲水性，其是一种有用的量度，该量度据报告与抗原性和免疫原性充 分相关。美国专利第4,554,101号，其整体并入本文作为参考。具有类 似亲水值的氨基酸的置换可产生保留生物活性的肽，例如免疫原性， 如在本领域应理解的。置换可以利用亲水值在+2内的氨基酸间彼此进 行。氨基酸的疏水指数和亲水值都受该氨基酸的特点侧链的影响。与 该观察一致，与生物功能相配的氨基酸置换被理解为取决于氨基酸的 相对相似性，特别是这些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电 荷、大小以及其他性质所展现的。

"载体"可指含复制起始点的核酸序列。载体可以是质粒、酵母或 哺乳动物人工染色体。载体可以是RNA或DNA载体。载体可以是自 我复制的染色体外载体或融入宿主基因组的载体。

2.Toll-样受体

本文提供了Toll-样受体(TLR)，其可以是一类模式识别受体 (PRR)。所示TLR可识别作为源自病原体的保守分子产物的分子，所 述病原体包括革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌、真菌和病毒，但是所述 分子可区别于宿主分子，被统称为病原体相关分子模式(PAMPs)。TLR 还可以识别从受伤或死亡细胞释放的分子，统称为损害相关分子模式 (DAMPs)。PAMP或DAMP可以是如下面进一步所述的TLR激动剂。 所述TLR可以是片段、变体、类似物、同系物或衍生物，其募集细胞 的细胞质内的衔接分子（adapter molecules），以便传播信号。TLR可 以来自人或其他哺乳动物物种，诸如猕猴、小鼠或大鼠。TLR可以与 募集细胞的细胞质内的衔接分子以便传播信号的TLR具有至少 30-99%同一性。

TLR可以是估计存在于大多数哺乳动物物种中的10到15种TLR 之间的一种。TLR可以是已经在人类和小鼠中一起鉴定的13种(简单 称为TLR1至TLR 13)TLR之一，或者可以是已经发现于其他哺乳动 物物种中的等价形式。TLR可以是在人类中已经鉴定的11个成员 (TLR1-TLR11)之一。

TLR可以被不同类型的免疫细胞表达，而且可以位于细胞表面上 或细胞质中。TLR可以在癌细胞上表达。TLR可以通过消化系统中的 正常上皮细胞、皮肤中的正常角质细胞、肺泡和支气管上皮细胞以及 雌性生殖系统中的上皮细胞表达。这些铺衬（lining）器官的细胞可以 是抵抗微生物入侵的第一道防线，而且在上皮细胞中表达的TLR在调 节增殖和细胞凋亡方面具有关键作用。

TLR-表达癌细胞可以选自下表：

表1在人类癌细胞中的TLR表达

癌症类型TLR胃癌 TLR2,TLR4,TLR5,TLR9 结肠直肠癌 TLR2,TLR3,TLR4,TLR5,TLR9 卵巢癌 TLR2,TLR3,TLR4,TLR5 子宫颈癌 TLR3,TLR4,TLR5,TLR9 肺癌 TLR2,TLR3,TLR4,TLR9 前列腺癌 TLR4,TLR9 黑素瘤 TLR2,TLR3,TLR4 脑癌 TLR2,TLR4 乳腺癌 TLR2,TLR3,TLR4,TLR9 肝细胞癌 TLR2,TLR3,TLR4,TLR6,TLR9 喉癌 TLR2,TLR3,TLR4

在癌细胞上表达的TLR可以上调NF-[κ]B级联并产生有助于致癌 作用和癌细胞增殖的抗凋亡蛋白。

已知TLR的四种衔接分子参与信号转导。这些蛋白质被称为髓样 分化因子88(MyD88)、Tirap(也称为Mai)、Trif和Tram。衔接子 （adapters）激活细胞内的其他分子，包括某些蛋白质激酶(IRAKI, IRAK4,TBK1和IKKi)，所述激酶扩增信号并最终导致诱导或抑制指挥 炎性反应的基因。病原识别过程中的TLR信号转导（signaling pathway） 经由由MyD88、激活B细胞的核因子κ-轻链增强(NF-κB)以及丝裂原 相关蛋白激酶(MAPK)介导的胞外和胞内途径可诱导免疫反应。总言 之，成千上万的基因通过TLR信号转导激活，而且总体而言，TLR构 成用于基因调节的一种最多效而又紧密调节通道。

TLR连同白介素-1受体形成受体超家族，称为"白介素-1受体/Toll- 样受体超家族"。该家族的所有成员具有共同的所谓的TIR(Toll-IL-1 受体)结构域。TIR结构域的亚组可能存在。含亚组I TIR结构域的蛋 白质是白介素受体，其通过巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞产生并 且都具有胞外免疫球蛋白(Ig)结构域。含亚组II TIR结构域的蛋白质 是经典TLR，并与微生物起源的分子直接或间接结合。含TIR结构域 (III)的蛋白质的第三亚组由转接蛋白组成，其是专有的细胞质基质的， 而且介导来自亚组1和2蛋白质的信号转导。TLR可以是保留了亚组 I TIR结构域、亚组II TIR结构域或亚组III TIR结构域的片段、变体、 类似物、同系物或衍生物。

TLR可具有二聚体的功能。例如，尽管大部分TLR似乎具有均二 聚体（homodimer）功能，但是TLR2与TLR1或TLR6形成异二聚体， 每个二聚体具有不同的配体特异性。TLR还可依赖于其他共受体，以 实现完全配体敏感性，诸如在需要MD-2的LPS的TLR4识别的情况 中。已知CD14和LPS结合蛋白(LBP)促进LPS向MD-2的呈递。

a.TLR1

TLR可以是TLR1，其识别对革兰氏阳性细菌具有特异性的 PAMP。TLR1也已经被命名为CD281。

b.TLR5

TLR可以是Toll-样受体5。由TLR-5编码的蛋白质可在病原体识 别和先天性免疫激活中起基本作用。TLR-5可识别PAMP，其在致病 原上表达并介导有效免疫发展所必需的细胞因子生产。TLR-5可识别 细菌鞭毛蛋白，其是菌鞭毛的一种主要成分和一种毒力因子。TLR的 激活可以调动核因子NF-[κ]B并刺激肿瘤坏死因子α产生。

3.Toll-样受体激动剂

本文还提供了TLR激动剂。TLR激动剂可以是PAMP，其可以是 得自病原体的保守分子产物。所述病原体可以是革兰氏阳性细菌、革 兰氏阴性细菌、真菌或病毒。TLR激动剂可以是损害相关分子模式 (DAMP)配体，其可以是从受伤或死亡细胞释放的内源分子。DAMP或 PAMP可通过TLR信号引发免疫应答并募集细胞的细胞质内的衔接分 子以便传播信号。TLR激动剂可以是TLR的激动剂，其可以是来自表 2中的下述的配体：

表2TLR和配体

TLR激动剂可以是结合TLR并诱导TLR-介导活性诸如NF-κB活 性激活的PAMP或DAMP的片段、变体、类似物、同系物或衍生物。 TLR激动剂的片段、变体、类似物、同系物或衍生物与TLR-激动剂的 氨基酸可具有至少30-99%的同源性并诱导TLR-介导的活性。

TLR激动剂可以靶向TLR诸如TLR-5。TLR激动剂可以是TLR-5 的激动剂并刺激TLR-5活性。TLR激动剂可以是抗-TLR5抗体或其他 小分子。TLR激动剂可以是鞭毛蛋白。

鞭毛蛋白还可以是鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关多肽。鞭毛蛋白可以 来找任何来源，包括多种革兰氏阳性细菌物种和革兰氏阴性细菌种类。 鞭毛蛋白可以是来任意格兰仕阳性或革兰氏阴性细菌物种的鞭毛蛋白 多肽，其包括但不限于美国专利公开第2003/000044429号中公开的鞭 毛蛋白多肽，该专利公开的内容整体并入本文作为参考。例如，鞭毛 蛋白可以具有来自美国专利公开第2003/0044429号的图7中所述的细 菌物种的氨基酸序列。编码U.S.2003/0044429的图7中所列的鞭毛蛋 白多肽的核苷酸序列在包括数据库在内的资源上公众可得。鞭毛蛋白 还可以是对应于美国专利公开第2003/0044429号图25所示的BLAST 结果中所列的登录号的鞭毛蛋白肽或其变体。鞭毛蛋白还可以是如在 美国专利申请公布第2009/0011982号中公开的鞭毛蛋白多肽，该文献 的内容全部并入本文。鞭毛蛋白可以是本文图6和7所公开的鞭毛蛋 白多肽的任一种。

鞭毛蛋白可以是结合TLR5并诱导TLR5-介导活性诸如NF-[κ]B活 性激活的鞭毛蛋白的片段、变体、类似物、同系物或衍生物。鞭毛蛋 白的片段、变体、类似物、同系物或衍生物与结合TLR5并诱导TLR5- 介导活性的鞭毛蛋白氨基酸可具有至少30-99%的同源性并诱导TLR- 介导的活性。

鞭毛蛋白可以来自沙门氏菌属，其代表性实例是都柏林沙门氏菌 (S.dublin)(由GenBank登录号M84972编码)。鞭毛蛋白相关的多肽可 以是M84972的片段、变体、类似物、同系物或衍生物，或者其组合， 其与TLR5结合并诱导TLR5-介导的活性，诸如NF-κB活性的激活。 鞭毛蛋白的片段、变体、类似物、同系物或衍生物可以基于鞭毛蛋白 的域结构和由TLR5识别的保守结构通过基于合理性的设计 （rational-based design）获得。

鞭毛蛋白可以包括如在图5中所示的13个保守氨基酸(位置89、 90、91、95、98、101、115、422、423、426、431、436和452)中至 少10个、11个、12或13个。鞭毛蛋白与M84972的氨基酸1174和 418505可具有至少30-99%的同源性。美国专利公布第2009/0011982 号的图26（其内容全部并入本文）列举了具有已知TLR-5刺激活性的 鞭毛蛋白与M84972相比的氨基端和羧基端的同一性百分比。

鞭毛蛋白可以是细菌鞭毛蛋白的主要成分。鞭毛蛋白可由三个结 构域组成(图4)。结构域1(D1)和结构域2(D2)可以是不连续的，并且 可以在氨基末端和羧基末端中的残基并列时通过形成发夹结构而形 成。包含D1和D2结构域的氨基和羧基末端是最保守的，然而中间的 高变结构域(D3)可以是高度可变的。对由大肠杆菌铰链 (ND1-2/ECH/CD2)分离的、含氨基D1和D2以及羧基D1和D2的重组 蛋白的研究表明，D1和D2当与ECH元件偶联结合时可以是生物活性 的。这种嵌合体在两种肠上皮细胞系中可诱导IkBa降解、NF-κB激活 以及NO和IL-8生产，但其并非是单独的铰链。非保守性D3结构域 可位于鞭毛丝状体的表面上并且可含有主要的抗原表位。鞭毛蛋白有 效的促炎活性可存在于高度保守的N和C D1与D2区域中(见图4)。

鞭毛蛋白通过与Toll-样受体5(TLR5)结合可诱导NF-κB活性。 TLR可识别对鞭毛蛋白特有的保守结构。该保守结构可由大组残基组 成，所述残基稍微允许氨基酸含量变化。Smith等,Nat Immunol.4: 1247-53(2003)（其内容引入本文作为参考）中已经鉴定了鞭毛蛋白中 的13种保守氨基酸，其构成由TLR5识别的保守结构的一部分。对 TLR5活性重要的鞭毛蛋白的该13个保守氨基酸示于图5中。

已经制得了鞭毛蛋白的很多缺失突变体，其保留了至少一些TLR5 刺激活性。鞭毛蛋白可以是此类缺失突变体，并且可以是在本文实施 例中公开的缺失突变体。鞭毛蛋白可包含翻译自GenBank登录号 D13689、失去氨基酸185-306或444-492的序列，或者翻译自GenBank 登录号M84973、失去氨基酸179-415的序列，或者其变体。

鞭毛蛋白可包含转座子插入和对可变D3结构域的改变。该D3结 构域可以用铰链或连接多肽（linker polypeptide）部分置换，铰链或连 接多肽使得D1和D2结构域能够适当折叠，以使变体刺激TLR5活性。 变体铰链元件（hinge elements）可见于大肠杆菌MukB蛋白质中，并 且可具有如以SEQ ID NOS:3所述的序列，或其变体。

如上所述的鞭毛蛋白还可包含前导序列。进一步包含前导序列的 鞭毛蛋白可以是CBLB502S。

4.药剂

本发明还涉及包含治疗有效量的TLR和TLR激动剂的药剂。该药 剂可以独立于TLR激动剂而递送TLR。该药剂可以是载体。该载体可 以包含编码该TLR的第一核酸和包含TLR激动剂的第二核酸。该载体 能够转导哺乳动物细胞。所述载体利用强启动子能够进行TLR和/或 TLR激动剂的双顺反子表达。所述载体可以仅包含编码TLR的基因， 其可被强启动子控制。载体可以通过病毒或脂质体相关的载体系统而 被递送到哺乳动物细胞中。病毒载体系统可以是腺病毒或巨细胞病毒。

药剂可以是包纳（harboring）载体的脂质体。该脂质体能够转导 哺乳动物细胞并递送载体用于表达。

药剂可以是药物制剂，其同时诱导表达并激活TLR，从而将肿瘤 或感染细胞暴露于宿主免疫系统，该系统模仿大量渗透经过肠壁的情 况。药剂可以是联合TLR激动剂表达TLR的药物制剂，并且可以以溶 液全身递送用于诸如肌内施用。药剂可以是联合TLR激动剂表达TLR 的药物制剂，TLR激动剂可以从同一载体表达，诸如腺病毒或巨细胞 病毒载体系统。药剂可以是联合了以纳米颗粒形式表达的TLR激动剂 的表达TLR的药物制剂，TLR激动剂可将功能性激动剂运送至哺乳动 物细胞的细胞表面。

药剂可以是包含上述药物配方的药物制剂，其可以利用本领域熟 知的方法制备。药剂还可以包含共药剂（coagent）。

载体可以包含编码该TLR5的第一核酸和包含鞭毛蛋白的第二核 酸。载体可利用强启动子表达TLR5和/或鞭毛蛋白。表达载体还可包 含在编码TLR或TLR5和/或鞭毛蛋白的基因上游克隆的前导序列。表 达载体可以是基于pCD515的载体系统。表达载体可以是如在图1A中 所述的pCD515-CMV-hTLR5-EF 1-502。表达载体可以是如在图1B中 所述的pCD515-CMV-hTLR5。表达载体可以是如在图1C中所述的 pCD515-CMV-Sseap-502

药剂可以是药物制剂，其同时诱导表达并激活TLR，从而将肿瘤 或感染细胞暴露于宿主免疫系统，该系统模仿大量渗透经过肠壁的情 况。该药物制剂可以是包纳载体的病毒表达系统。药物制剂可以是与 下述联合的腺病毒表达功能性人TLR5：

TLR激动剂，其以溶液全身递送用于诸如肌内施用；

TLR激动剂，其从与TLR相同的腺病毒载体表达；或

TLR激动剂，其以携带功能性TLR激动剂诸如鞭毛蛋白的纳米颗 粒的形式在所述颗粒表面上表达，鞭毛蛋白可得自CBLB502。纳米颗 粒可以基于噬菌体T7，或者完整形成以保留期生物活性。纳米制剂可 以提供剂量依赖型、NF-KB-响应性reporter activation，并且可以通过 内吞作用导致细胞内在化，实现有效免疫途径(Mobian AP-A)。

a.施用

利用本文所述方法的药剂的施用可以是口服施用、肠胃外施用、 舌下施用、透皮施用、直肠施用、透粘膜施用、局部施用、经吸入施 用、经颊施用或其组合。肠胃外施用包括但不限于静脉内、动脉内、 腹膜内、皮下、肌内、鞘内和关节内施用。对于兽医应用，药剂可以 按照正常兽医实践作为合适的可接受的制剂来施用。兽医可容易地确 定给药方案和对特定动物而言最适宜的给药途径。药剂可以被施用于 人类患者、猫、狗、大动物或鸟类

药剂可以与其他治疗同时或有节奏地施用。如本文所用的术语"同 时的"或"同时地"指所述药剂与其他治疗在48小内、优选24小时、更 优选12小时、还更优选6小时以及最优选3小时或更少内彼此施用。 如本文所用的术语"有节奏地"指相对于重复施用，所述药剂在不同于 其他治疗的时间以及以一定的频率施用。

药剂可以在在另一治疗之前的任意时刻施用，包括约120小时、 118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106 小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、 92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78 小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64 小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50 小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36 小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22 小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小 时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45 分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10 分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2 分钟和1分钟。药剂可以在药剂的第二治疗之前的任意时刻施用，包 括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、 108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小 时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、 80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66 小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52 小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38 小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24 小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10 小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50 分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15 分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3 分钟、2分钟和1分钟

药剂可以在另一治疗之后的任意时刻施用，包括约1分钟、2分钟、 3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、 15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50 分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10 小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24 小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38 小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52 小时、54小时、56小时、58小时、60小时、62小时、64小时、66 小时、68小时、70小时、72小时、74小时、76小时、78小时、80 小时、82小时、84小时、86小时、88小时、90小时、92小时、94 小时、96小时、98小时、100小时、102小时、104小时、106小时、 108小时、110小时、112小时、114小时、116小时、118小时和120 小时。药剂可以在药剂的第二治疗之后的任意时刻施用，包括约120 小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、 106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、 92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78 小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64 小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50 小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36 小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22 小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小 时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45 分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10 分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2 分钟和1分钟。

b.配制

方法可包括施用所述药剂。本文提供的药剂可以是以常规方式配 制的片剂或锭剂。例如，用于口服施用的片剂和胶囊可含常规赋形剂， 其可以是粘结剂、填料、润滑剂、崩解剂和湿润剂。粘结剂包括但不 限于糖浆、金合欢属（accacia）、明胶、山梨糖醇、黄芪胶、淀粉粘 液和聚乙烯吡咯烷酮。填料可以是乳糖、糖、微晶纤维素、玉米淀粉、 磷酸钙和山梨糖醇。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、 聚乙二醇和硅石。崩解剂可以是马铃薯淀粉和淀粉乙醇酸钠。湿润剂 可以是十二烷基硫酸钠。片剂可以按照本领域熟知的方法进行涂覆。 本文提供的药剂还可以是液体制剂，诸如水性或油状混悬剂、溶液、 乳剂、糖浆和酏剂。药剂还可以以干品配制，用于在使用前用水货其 他合适的载体构造。此类液体制剂可以含有添加剂，诸如悬浮剂、乳 化剂、非水性媒介物和防腐剂。悬浮剂可以是山梨糖醇液、甲基纤维 素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝 胶和氢化食用油脂。乳化剂可以是卵磷脂、单油酸脱水山梨糖醇酯和 阿拉伯胶。非水性媒介物可以是食用油、杏仁油、分馏椰子油、油脂、 丙二醇和乙二醇。防腐剂可以是对羟基苯甲酸甲酯或丙酯和山梨酸。

本文提供的药剂还可作为栓剂配制，其可含有栓剂基体，诸如可 可脂或甘油酯。本文提供的药剂还配制用于吸入，其可以是诸如溶液、 混悬剂或乳剂的形式，其可作为干粉末施用或者利用推进剂的气雾剂 形式，推进剂诸如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷。本文提供的药剂配制 为包含水性或非水性媒介物的经皮制剂，诸如霜剂、软膏剂、洗剂、 糊剂、膏药、贴片剂或膜。

本文提供的药剂还可配制用于肠胃外施用，诸如通过注射、肿瘤 内注射或连续输注。注射用制剂可以是在油状或水性媒介物中的混悬 剂、溶液或乳剂的形式，并且其可含有配制剂，包括但不限于悬浮剂、 稳定剂和分散剂。药剂还可以粉末形式提供，用于利用合适的媒介物 重构，所述媒介物包括但不限于无菌无热源水。

本文提供的药剂还可配制为药性持久制剂（depot preparation）， 其可以通过植入或通过肌内注射施用。所述药剂可以用合适的高分子 材料或疏水材料(例如，作为可接受油中的乳剂)、离子交换树脂或作为 微溶衍生物(例如，作为微溶性盐)配制。

c.剂量

所述方法可包括向需要其的患者施用治疗有效量的所述药剂。治 疗应用所需的治疗有效量随被治疗病症的性质、激活TLR活性所述的 时间长度以及患者的年龄/状况而变。但是，一般而言，成年人治疗所 用的剂量通常在0.001mg/kg/天至约200mg/kg/天的范围内。剂量可以 是约1mg/kg/天至约100mg/kg/天。所期望的剂量可以单次剂量常规施 用，或作为多剂量在适当间隔施用，例如作为每天两个、三个、四个 或更多个次剂量。多剂量可能是期望的或是必需的。

所述剂量可以处于任意剂量，诸如约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3 mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9 mg/kg、1mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、 150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、250mg/kg、275mg/kg、 300mg/kg、325mg/kg、350mg/kg、375mg/kg、400mg/kg、425mg/kg、 450mg/kg、475mg/kg、500mg/kg、525mg/kg、550mg/kg、575mg/kg、 600mg/kg、625mg/kg、650mg/kg、675mg/kg、700mg/kg、725mg/kg、 750mg/kg、775mg/kg、800mg/kg、825mg/kg、850mg/kg、875mg/kg、 900mg/kg、925mg/kg、950mg/kg、975mg/kg或1mg/kg。

5.治疗癌症的方法

本文提供了一种通过向需要其的哺乳动物施用药剂来治疗癌症的 方法。该方法提供了抗癌症的免疫治疗，其通过利用TLR靶向肿瘤内 刺激将肿瘤细胞转化成TLR激动剂响应状态从而使免疫应答集中在肿 瘤。该方法可用于在手术去除前治疗原发性肿瘤以降低转移发展风险 以及治疗其他肿瘤结节（tumor nodule）。该方法可包括瘤内注射。该 方法可具有在手术去除之前将所述药剂注射进原发性肿瘤中以降低转 移发展风险以及治疗其他肿瘤结节的步骤。所述方法可用于治疗腺病 毒瘤内注射可及的任意肿瘤

按照本发明可以治疗多种癌症，包括：恶性上皮肿瘤、膀胱癌(包 括加速性膀胱癌和转移性膀胱癌)、乳腺癌、结肠癌(包括结肠直肠癌)、 肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢 癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌症、直肠癌、喉 癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、食道癌、胃癌、胆囊癌、子宫颈癌、 甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系的造血肿瘤，包括白血病、 急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、 T-细胞淋巴瘤、霍杰金淋巴瘤、非霍杰金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组 织细胞性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤(Burketts lymphoma)；骨髓系的造血肿 瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病、脊髓发育不良综合征、髓细胞 性白血病和前髓细胞性白血病；中枢和末梢神经系统的肿瘤，包括星 形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质细胞起源 的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)和骨肉瘤； 以及其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病(xenoderma pigmentosum)、 角化棘皮瘤（keratoactanthoma）、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌(thyroid follicular cancer)、畸胎癌以及胃肠道或盆腹腔的癌症

本方法可以与其他方法联合用于治疗癌症，包括应用免疫刺激剂 或化学治疗剂。免疫刺激剂可以是生长激素、促乳素或维生素D。

6.感染细胞的治疗

本文提供了一种通过由药剂同时递送转导细胞来治疗传染病的方 法。该方法可用于治疗病毒、细菌、原生动物寄生虫或真菌感染。该 方法可用于治疗任何传染病，其是通过利用细胞内注射，其导致具有 最低全身作用的感染细胞的TLR信号传导的自分泌激活，从而使得能 够吸引对感染细胞特定的先天性免疫应答。该方法可与其他治疗相结 合，用于治疗病毒、细菌、原生动物寄生虫或真菌感染。

该方法可包括施用药剂。该方法可包括施用包含所述药剂的疫苗， 并且可以与任何其他接种联合使用，其可包括表达选择抗原的构建物。

实施例

实施例1双顺反表达TLR5/鞭毛蛋白载体的合成以及肿瘤细胞 的治疗

创建用于表达Toll-样受体5(TLR-5)和鞭毛蛋白CBLB502的载体 构建物。载体pCD515用作这些构建物的骨架。人类TLR-5的cDNA 序列和编码Toll-样受体激动剂的CBLB502的DNA与源自碱性磷酸酶 的前导肽单独融合，使得能够将表达蛋白发送经过内质网(ER)和高尔 基体用于胞外分泌。

pCD515-CMV-hTLR5-EFl-502s载体构建物在细胞表面表达 CBLB502鞭毛蛋白(CBLB502S)和Toll-样受体5(TLR5)的分泌形式。 该腺病毒载体需要对CBLB502进行修饰，以通过哺乳动物细胞实现其 有效合成和分泌。腺病毒构建物包含前导核酸序列 (Atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggc)，该序列源自碱性 磷酸酶并在截短的沙门氏菌鞭毛蛋白(fliC)基因的上游被克隆(见 Burdelya等,Science 320:226-230(2008)，以便编码鞭毛蛋白的分泌形式 (即，CBLB502S)。EF1(延伸因子la)启动子在该编码CBLB502S的盒 的上游克隆。TLR5基因得自人类并且具有如图9所示的氨基酸序列。 CMV启动子在TLR5基因的上游克隆。该构建物共表达TLR5和 CBLB502S。该构建物示于图1A中。

构建pCD515-CMV-hTLR5表达载体，以表达人TLR-5形式(见图 9)。腺病毒构建物包含在hTLR5盒上游克隆的强CMV启动子。该构 建物示于图1B中。

构建pCD515-CMV-Sseap-502表达载体，以表达分泌的鞭毛蛋白 CBLB502和toll-样。腺病毒构建物包含在前导序列SEAP 502鞭毛蛋 白(fliC)基因的上游克隆的强CMV启动子。该构建物示于图1C中。[需 要克隆信息]

实施例2双顺反表达TLR5/鞭毛蛋白载体的合成和肿瘤细胞的治 疗

用载体构建物pCD515、pCD515-CMV-hTLR5-EF1-502、 pCD515-CMV-hTLR5-502、pCD515-CMV-hTLR5和pCD515-CMV- Sseap-502转导两种报道哺乳动物细胞系，其都表达NF-kB-相应GFP 而且其TLR5状态不同(见下面表3)。

表3作为TLR5信号激活剂的腺病毒构建物的活性

共表达TLR5和TLR5激动剂CBLB502S的载体足以诱导NF-kB 报道基因在293-裸细胞中的表达，该293-裸细胞不表达任何已知的 TLR，而且其不能被单独的TLR5激动剂激活。该实验展示TLR5和 鞭毛蛋白CBLB502S能以反位或顺位激活TLR5发信号。

实施例3

为测试含有(pCD515-CMV-hTLR5-EFl-502s)的双顺反腺病毒的抗 肿瘤效应，当Balb/c小鼠中源自CT26小鼠结肠癌的两种皮下生长的 同种同基因肿瘤直径达到3-5mm时，将10ml腺病毒悬浮液(1012-1011 IU/ml)注射两种肿瘤之一中，并监控肿瘤大小，直到对照非注射肿瘤达 到需要终止实验的尺寸极限。使对照小鼠注射(再次，每只小鼠注射两 种肿瘤中的一种)表达红色荧光蛋白(RFP)的腺病毒载体。代表性实验的 结果示于图4中。与注射了RFP-表达腺病毒的对照动物中的肿瘤相比， 注射了(pCD515-CMV-hTLR5-EFl-502s)的肿瘤几乎完全不生长，且同 一动物中的未注射肿瘤的生长降低。该结果表明了 pCD515-CMV-hTLR5-EFl-502s的(i)有效的顺位效应和(ii)可见的反位 效应，其表示对先天性(顺式效应)适应性(反式效应)免疫应答的募集。 表1中所列的单独注射的其他对照病毒(即，AD5(对照)和Ad5(TLR5)) 无一对肿瘤具有生长抑制作用。

因此，增强的TLR5异位表达使得最初为TLR5不足的肿瘤细胞类 型对TLR5刺激高度响应，导致破坏肿瘤免疫耐受性，有效地吸引可 促进具有随后的综合抗肿瘤作用的适应性免疫应答发展的先天性免疫 应答。