冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法

摘要

本发明涉及一种冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法。本发明方法以抗MTG兔多抗为包被抗体，抗MTG鼠单抗为检测抗体，再结合HRP标记的抗IgG1二抗，构成双抗体夹心ELISA检测方法，对冷冻鱼糜中是否添加MTG进行定量检测。本发明方法检测限为20ng/mL，该检测方法在0.6mg/mL～10mg/mL范围内OD450值与MTG浓度的log值呈线性关系，冷冻鱼糜样品添加回收率为94％以上，板内变异系数为1.12％～4.02％，板间变异系数为5.43％～6.87％。本发明方法灵敏度高，样品前处理简便，适用于冷冻鱼糜中MTG的定量检测，防止冷冻鱼糜原料掺假。

说明书

技术领域

本发明涉及一种冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法，属 于食品安全检测技术领域。

背景技术

随着生活水平不断提高，生活节奏日益加快，人们对既安全卫生又富 含营养、方便快捷的水产加工食品越发青睐，促使冷冻鱼糜及其制品加工 工业的蓬勃发展。目前，生产冷冻鱼糜的原料主要集中于阿拉斯加狭鳕、 太平洋鳕等海水鱼。但由于以往过大的海洋捕捞强度以及环境污染等原 因，近年来主要海洋经济鱼类已严重枯竭，导致海水鱼糜的生产成本上升。 一些不良商贩在制作冷冻鱼糜的过程中通过添加微生物谷氨酰胺转胺酶 (MTG)来增强低等级冷冻鱼糜的凝胶强度将其当做高等级冷冻鱼糜进 行贩卖，此种行为严重地损害了鱼糜制品企业的利益，不利于冷冻鱼糜行 业健康有序地发展。

MTG是微生物发酵产的谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TGase， EC 2.3.2.13)，它通过催化酰基转移反应促进蛋白质之间产生交联反应 生成网络状超大蛋白质分子，从而提高蛋白质的凝胶强度，进而改善食品 中蛋白质的质构、外观和风味。为了规范鱼糜原料市场，预防掺伪原料导 致鱼糜制品加工过程产生品质劣变，建立一种可靠的MTG检测方法迫在 眉睫。目前国内对MTG的检测研究仅限于MTG的酶活检测，对于含有 内源性TGase的鱼糜而言，酶活检测并不能确定冷冻鱼糜中是否添加了 MTG。ELISA(酶联免疫吸附法)是一种把抗原抗体反应的特异性和酶的 专一高效催化底物能力二者相结合而设计的检测方法，该检测方法将具有 灵敏度高、特异性强等特点，已经广泛应用于生物学、医学等领域。

发明内容

本发明的目的是通过建立双抗体夹心ELISA方法对冷冻鱼糜中的 MTG进行定量检测，为鱼糜加工企业检测冷冻鱼糜原料中是否添加了 MTG提供技术支持。

本发明的技术方案为：

一种冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法，包括以下步 骤：

①包被：抗MTG兔多抗用包被缓冲液进行稀释至1-3ug/mL，以每孔 100uL的量加入酶标板进行包被，4℃冰箱反应12h；

②洗涤：将酶标板甩干，每孔加入200uL洗涤液，振荡3min，甩干液 体并拍干酶标板，重复洗涤3次；

③封闭：每孔100uL封闭液，37℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述 洗涤步骤；

④加抗原：抗原样品与样品稀释液在乳化机作用下匀浆3min，得到的浆 液磁力搅拌12h，之后再6000rpm离心15min，取上清液再次离心(6000rpm 15min)，离心得到的上清液即为待测样品；每孔加入100uL待测样品，37 ℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述洗涤步骤；

⑤加检测抗体：抗MTG鼠单抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入100 uL，37℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述洗涤步骤；

⑥加酶标二抗：酶标二抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入100uL，37 ℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述洗涤步骤；

⑦加显色液：将显色A液、显色B液、30％H₂O₂以200:5000:1的比例 混合，每孔加入100uL，37℃烘箱反应15min；

⑧加终止液：每孔加入100uL终止液，用酶标仪测定OD₄₅₀值；

⑨按①-⑧的检测方法进行操作，绘制双抗体夹心ELISA法MTG浓度 测定曲线，以抗原浓度的log值为横坐标，各孔的OD₄₅₀值为纵坐标；

⑩掺假冷冻鱼糜按0.6mg/mL～10mg/mL进行稀释处理，然后按照①-⑧ 的检测方法进行操作，通过标准曲线计算测定浓度。

所述的包被缓冲液为0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液。

所述的洗涤液为含0.05％(v/v)Tween-20的0.01mol/LpH7.4的磷酸盐缓 冲溶液。

所述的封闭液/抗体稀释液为含0.5％(m/v)BSA的洗涤液。

所述的样品稀释液为0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液。

所述的显色液A液为5mg/mL的TMB二甲亚砜溶液。

所述的显色液B液为pH5.0柠檬酸缓冲液。

所述的终止液为2mol/LH₂SO₄溶液。

所述的步骤⑤中，抗MTG鼠单抗用抗体稀释液进行稀释0.05-0.15 ug/mL。

所述的步骤⑥中，酶标二抗用抗体稀释液进行稀释至1:5000-1:6000。

本发明的有益效果：本发明方法灵敏度高、回收率高、变异系数小，且 易于操作，为应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测冷冻鱼糜中MTG提供了 实验依据。目前市场上没有检测MTG的商业化ELISA试剂盒，可以本发明 为基础，进一步构建MTG检测的商业化ELISA试剂盒。

附图说明

图1冷冻鱼糜MTG最小添加量的确定。

图2多抗-抗原-单抗夹心ELISA结果。

图3MTG含量标准曲线。

具体实施方式

下面通过实例进一步说明本发明的技术内容和效果。

主要试剂

抗MTG兔多抗，德国Zedira公司；抗MTG鼠单抗，法国Covalab公司； 抗IgG1的HRP-二抗，美国SouthernBiotech公司；微生物谷氨酰胺转胺酶， 日本味之素公司；铜盆鱼冷冻鱼糜，宁波锦海水产食品有限公司；其余试剂 均购买自国药集团化学试剂有限公司。

主要设备

酶标仪MultiscanGo型，美国Thermo公司；酶标板，丹麦NUNC公司； 离心机4K15型，美国sigma公司；隔水式恒温培养箱GRP-9160型，上海森 信实验仪器有限公司；电子天平AB104-N型，美国Mettler.Toledo公司；高 速乳化机FA25型，中国FLUKO公司；脱色摇床TS-1000型，海门市其林 贝尔仪器制造有限公司。

冷冻鱼糜凝胶强度的测定

冷冻鱼糜预解冻后在低温下斩拌，斩拌结束后立即用灌肠机将浆料灌入 折径为52mm的肠衣中，扎牢二端口。将鱼肠放入90℃±1℃水浴锅中，保持 温度加热30min后，立即取出并投入冰水中，充分冷却15min～20min，取 出置于4℃冰箱中，静置12h。将冷却后的鱼肠剥去肠衣，切成25mm鱼糕 段，用质构仪测定其凝胶强度，每个样品10个平行。

双抗体夹心ELISA检测方法

检测所需溶液：包被缓冲液：0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液；洗涤 液：含0.05％(v/v)Tween-20的0.01mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲溶液；封闭液 /抗体稀释液：含0.5％(m/v)BSA的洗涤液；样品稀释液：0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液；显色液A液：5mg/mL的TMB二甲亚砜溶液；显色液B 液：pH5.0柠檬酸缓冲液；终止液：2mol/LH₂SO₄溶液。

检测方法：①包被：抗MTG兔多抗用包被缓冲液进行稀释，以每孔100 uL的量加入酶标板进行包被，4℃冰箱反应12h。②洗涤：将酶标板甩干， 每孔加入200uL洗涤液，振荡3min，甩干液体并拍干酶标板。按上述方法 重复洗涤3次。③封闭：每孔100uL封闭液，37℃烘箱反应1h，反应结束 后重复上述洗涤步骤。④加抗原：抗原样品与样品稀释液在乳化机作用下匀 浆3min，得到的浆液磁力搅拌12h，之后再6000rpm离心15min，取上清液 再次离心(6000rpm 15min)，离心得到的上清液即为待测样品。每孔加入100 uL待测样品，37℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述洗涤步骤。⑤加检测 抗体：抗MTG鼠单抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入100uL，37℃烘箱 反应1h，反应结束后重复上述洗涤步骤。⑥加酶标二抗：酶标二抗用抗体稀 释液进行稀释，每孔加入100uL，37℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述洗 涤步骤。⑦加显色液：将显色A液、显色B液、30％H₂O₂以200:5000:1的 比例混合，每孔加入100uL，37℃烘箱反应15min。⑧加终止液：每孔加入 100uL终止液，用酶标仪测定OD₄₅₀值。

抗体最佳工作浓度和稀释倍数的确定

控制变量法：抗体优化顺序为首先优化包被抗体浓度，再优化检测抗体 浓度，最后优化酶标二抗浓度。优化的结果为选择ELISA显色OD值在1.0 左右的最小抗体浓度为抗体最佳工作浓度。①包被抗体:用包被缓冲液将抗 MTG兔多抗分别稀释至0.10、1.00、5.00ug/mL，按上述的检测方法进行操 作。根据实验结果缩小抗体浓度范围，再次稀释抗MTG兔多抗进行ELISA 实验，最终确定包被抗体最佳工作浓度。②检测抗体：用抗体稀释液将抗 MTG鼠单抗分别稀释至0.01、0.10、1.00ug/mL，按上述的检测方法进行操 作。根据实验结果缩小抗体浓度范围，再次稀释抗MTG鼠单抗进行ELISA 实验，最终确定检测抗体最佳工作浓度。③酶标二抗：将酶标二抗按1:5000、 1:6000、1:7000、1:8000进行稀释，按上述的检测方法进行操作，确定酶标 二抗最佳稀释倍数。

抗原最佳稀释倍数及检测灵敏度的确定

将MTG样品分别以1:10、1:20、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、 1:1500、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:10000、1:50000的稀释倍数稀 释，按上述的检测方法进行操作，绘制双抗体夹心ELISA法MTG浓度测定 曲线，以抗原浓度的log值为横坐标，各孔的OD₄₅₀值为纵坐标。

标准曲线的绘制

根据双抗体夹心ELISA法MTG浓度测定曲线，在与OD₄₅₀值有线性相 关性的抗原浓度范围内，以测定的抗体最佳工作浓度按上述的检测方法进行 操作，绘制冷冻鱼糜中MTG测定的标准曲线，以抗原浓度的log值为横坐 标，各孔的OD₄₅₀值为纵坐标，作图得到MTG浓度测定的标准曲线，如图1 所示。OD₄₅₀值与抗原浓度log值呈现明显的正相关，标准曲线的回归方程为 Y＝0.7633X-1.6448，R²＝0.9928。

冷冻鱼糜中MTG的回收实验

根据冷冻鱼糜凝胶强度的测定的实验结果，向冷冻鱼糜中添加不同浓度 MTG模拟掺假冷冻鱼糜。按得到的最佳抗原稀释倍数对掺假样品进行稀释 处理，然后按照本发明的检测方法进行操作。根据标准曲线计算添加MTG 的回收率，以及板内、板间样品测定的变异系数。

回收率＝测定浓度(mg/kg)/添加浓度(mg/kg)×100％

变异系数＝测得浓度的标准差(mg/kg)/测得浓度的平均值(mg/kg)×100％

冷冻鱼糜中MTG的添加量

要建立冷冻鱼糜中MTG的检测方法首先就要明确冷冻鱼糜中MTG的 添加量。目前鱼糜制品企业主要以冷冻鱼糜的凝胶强度来衡量冷冻鱼糜的品 质，且冷冻鱼糜的凝胶强度每增大100g*cm冷冻鱼糜的等级就上升一级， 因此本试验以较空白样品增大冷冻鱼糜凝胶强度100g*cm的MTG添加量视 为冷冻鱼糜中MTG的最小添加量。添加不同浓度MTG后鱼糜的凝胶强度 如图2所示，考虑到凝胶强度测定过程中的实验误差，本试验选定0.04％为 掺假冷冻鱼糜中MTG的最小添加量。

抗体最佳工作浓度和稀释倍数的确定

用控制变量法确定包被抗体、检测抗体、酶标二抗的最佳稀释倍数。实 验过程中抗体的浓度会影响检测反应的准确性和灵敏度，当抗体浓度过低 时，孔板内抗体少，可供抗原结合的抗原决定簇少，抗原不能被充分地特异 性结合，检测结果偏低不准确。当抗体浓度过高时基质效应可能比较明显， 降低了反应的灵敏度。一般情况下，OD值在1.0左右时误差相对较小，所 以选择OD₄₅₀值在1.0左右，阴性对照小的抗体浓度作为最佳工作浓度，结 果见表1-3。由表1-3可知，本试验中包被抗体最佳工作浓度为2.00ug/mL， 检测抗体最佳工作浓度为0.10ug/mL，酶标二抗最佳稀释倍数为1:5000。

表1  包被抗体最佳工作浓度的确定

表2  检测抗体的最佳工作浓度的确定

表3  酶标二抗的最佳稀释倍数的确定

抗原最佳稀释倍数及检测灵敏度的确定

将MTG样品用Tris-HCl缓冲液稀释至不同稀释倍数，通过双抗体夹心 ELISA法测定MTG的检测曲线，以抗原浓度的log值为横坐标，各孔的OD₄₅₀值为纵坐标，MTG浓度的检测曲线如图2所示。试验中空白组OD₄₅₀值为 0.050±0.002,以阳性值/阴性值>2.1作为判定阳性的标准，本试验中双抗体夹 心ELISA法的检测限为20ng/mL。由图2可知，抗原的吸光值随抗原浓度 log值的变化情况为：当抗原浓度为20ng/mL～250ng/mL时，随着抗原浓度 的增大吸光值几乎无变化；当抗原浓度为250ng/mL～600ng/mL时，随着抗原 浓度的增大吸光值缓慢增大；当抗原浓度为0.6mg/mL～10mg/mL时，吸光值 与抗原浓度log值呈线性正相关；当抗原浓度大于10mg/mL时，随着抗原浓 度的增大吸光值的增大趋势逐渐减小趋于平缓。从双抗体夹心ELISA法 MTG检测曲线可知，应在MTG的浓度为0.6mg/mL～10mg/mL范围内，绘 制MTG浓度定量测定的标准曲线。

冷冻鱼糜中MTG的回收实验

根据冷冻鱼糜中MTG的添加量的试验结果，通过斩拌的方法按MTG 浓度分别为0.04％、0.06％、0.08％、0.10％的比例将其添加到冷冻鱼糜中， 制得掺假模拟样品，掺假样品置于-20℃冰箱冷冻保存。用Tris-HCl缓冲液 提取样品中的MTG，并根据抗原最佳稀释倍数及检测灵敏度的确定的试验 结果将样品稀释400倍，将样品测得的吸光值带入标准曲线回归方程中计算 样品的测定浓度，再计算以双抗体夹心法检测样品中MTG的回收率以及变 异系数，实验结果见表4。

表4  双抗体夹心ELISA测定冷冻鱼糜中MTG的回收率

由表4可知，MTG的添加回收率在94％以上，板内变异系数范围为 1.12％～4.02％，板间变异系数范围为5.43％～6.87％。由于不同批次试验可能 受到96孔板、试剂、反应时间等因素的影响，板间变异系数大于板内变异 系数，但最终的变异系数均在检测方法的允许范围内。

本发明以双抗体夹心ELISA法为检测方法对模拟掺假冷冻鱼糜中MTG 的含量进行了测定，该方法的检测限为20ng/mL，添加回收实验中回收率在 94％以上，板内变异系数为1.12％～4.02％，板间变异系数为5.43％～6.87％。 该方法灵敏度高、回收率高、变异系数小，且易于操作，为应用酶联免疫吸 附法(ELISA)检测冷冻鱼糜中MTG提供了实验依据。目前市场上没有检 测MTG的商业化ELISA试剂盒，可以以本试验的结果为基础，进一步构建 MTG检测的商业化ELISA试剂盒。