一种酸奶发酵乳酸菌组合及发酵剂

摘要

本发明公开了一种酸奶发酵乳酸菌组合及发酵剂，属于发酵乳制品制备技术领域。该酸奶发酵乳酸菌组合由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组成；所述嗜热链球菌包括至少两株不同的菌株；不同菌株的生产性能互补，所述生产性能为产酸能力、产粘能力和抗噬菌体能力；或所述嗜热链球菌包括至少两株不同的菌株，不同菌株产酸能力和产粘能力互补，且不同的菌株噬菌体模式不同。由该酸奶发酵乳酸菌组合制备的发酵剂，采用具备不同性能优势的嗜热链球菌菌株复配，生产性能良好、稳定，缩短发酵时间，降低生产环境中的噬菌体污染，实用性强，同时所得发酵产品具备良好的口感、粘度和风味，品质提高。

说明书

技术领域

本发明涉及发酵乳制品工业中的酸奶发酵剂制备技术，尤其涉及一种酸奶 发酵剂菌株组成设计与其发酵剂。

背景技术

酸乳因其圆润滑厚的口感、丰富的营养以及良好的益生保健功能，越来越 受到广大消费者的青睐，近几年我国酸乳产量每年都以25％左右的速度在增长。 酸乳发酵剂一般由1株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、1株德氏乳杆 菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)组成，是酸乳生产 中的核心成分，是制作高品质酸乳的关键因素。目前，直投式发酵剂(Direct Vat Set,DVS)以其高浓度、高活力、稳定的生产性能而备受国内乳品生产企业青 睐。遗憾的是，由于技术水平的限制，目前国内尚无成熟的DVS产业，这一市 场被丹麦科·汉森、丹麦丹尼斯克、荷兰帝斯曼等几家外国公司所垄断，国内生 产企业每年需花费数亿元引进直投式酸乳发酵剂用于酸乳、干酪等发酵乳制品 生产。为了打破我国酸奶发酵剂被国外公司垄断的局面，近几十年来，国内科 研院所和大型乳品生产企业在酸奶发酵剂优良菌株选育、菌株高密度培养、浓 缩干燥工艺等方面投入了大量的人力物力进行技术攻关，取得了诸多进展。

对于生产菌株而言，产酸(乳酸)、产粘(胞外多糖多聚物等)、产香(乙 醛、双乙酰等风味物质)、抗噬菌体污染等生产性能优良菌株的选育以及优良性 能菌株的组合是DVS产业化的关键之一。尤其是嗜热链球菌菌株，其在酸奶前 期发酵产酸迅速降低体系pH值、产胞外多糖改善酸奶粘度与质构、产双乙酰 形成酸奶特有风味等方面发挥着重要作用，是酸奶生产中的最重要的发酵菌株。 但在实际生产、研究过程中，我们发现，对于某一嗜热链球菌菌株而言，它难 以同时具备产酸快、产粘好、抗噬菌体等优良性状。Mills等在筛选嗜热链球菌 噬菌体自发突变抗性菌株过程中发现，一些获得噬菌体抗性的菌株同时也失去 了产胞外多糖能力，并认为噬菌体敏感性基因与多糖产生基因有一定的关联性 [Mills S.et al.CRISPR analysis of bacteriophage-insensitive mutants(BIMs)of industrial Streptococcus thermophilus-implications for starter design.Journal of Applied Microbiology,2010,108:945-955]。因此，在酸奶发酵剂设计、开发过程 中，仅使用单株的嗜热链球菌菌株有其较大的局限性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有酸奶发酵均采用单株嗜热链球菌，难以同 时具备产酸快、产粘好、抗噬菌体等优良性状。

我们研究发现，将不同生产性能菌株组合，菌株间有一定的协同、互补作 用。如产酸快的嗜热链球菌菌株与产粘好的嗜热链球菌菌株复配结合，有助于 缩短发酵时间、改善产品粘度。噬菌体污染是发酵乳制品生产中的常见问题， 尤其是嗜热链球菌噬菌体，其多为烈性噬菌体，会导致酸奶发酵延迟甚至是失 败、产品口感粘度变差、风味下降。一些嗜热链球菌菌株可通过溶原性、吸附 抑制、质粒修饰系统、CRISPR等机制获得噬菌体抗性，但易出现菌株的产酸、 产粘、产香等生产性能下降。在实际生产中，酸奶、奶酪等发酵乳制品均易受 噬菌体污染。如发酵剂菌株组合中仅有1株嗜热链球菌噬菌体敏感菌株与1株 保加利亚乳杆菌，则前期嗜热链球菌有一定生长发酵产酸，随着噬菌体的快速 生长繁殖、嗜热链球菌受噬菌体侵染、裂解，嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌互 生关系的破坏，体系产酸缓慢、发酵时间延长、口感粘度变差。在研究过程中， 我们发现，将1株嗜热链球菌噬菌体敏感菌株、1株噬菌体抗性菌株、1株保加 利亚乳杆菌组合为多组分发酵剂，后期虽然噬菌体敏感菌株受侵染、裂解，但 噬菌体抗性菌株仍能发酵产酸、产粘，体系中嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌互 生关系仍然存在，产品发酵时间稳定、粘度口感良好。另一方面，研究发现， 噬菌体按包装结构分为cos-型和pac-型，敏感菌株只能受一类噬菌体的侵染， 即某一敏感菌株能被cos-型噬菌体侵染，则一般不会被pac-型噬菌体侵染。对 某一生产环境而言，其同时存在cos-型和pac-型噬菌体的概率非常低。因此， 将不同噬菌体模式的嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌组合为多组分发酵剂，也有 助于稳定、提高发酵剂实际生产性能。

基于以上研究，为了解决现有技术中的问题，经过大量分析和试验，本发 明提供了一种酸奶发酵乳酸菌组合。

本发明提供的酸奶发酵乳酸菌组合，由嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌(全称：德氏乳杆菌保加利亚亚种，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)组成，所述嗜热链球菌包括至少两株不同的菌株， 不同菌株的生产性能互补；所述生产性能为产酸能力、产粘能力和抗噬菌体能 力；或

所述嗜热链球菌包括至少两株不同的菌株，不同的嗜热链球菌菌株产酸能 力和产粘能力互补，且不同的菌株噬菌体模式不同。

所述的产酸能力是指菌株在发酵乳中乳糖产生乳酸的能力，以吉尔涅尔酸 度度(°T)表示。具体检测判断方法为：将菌株培养至对数生长期或稳定期， 按2％(质量百分比)的接种量接种发酵质量百分数为12％的灭菌还原脱脂乳， 42℃发酵6小时，测定其滴定酸度。酸度测定采用国家标准《食品安全国家标 准乳和乳制品酸度的测定》(GB5413.34-2010)，以酚酞为指示液，用0.1000 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定100g试样至终点所消耗的氢氧化钠溶液体积，经 计算确定试样的酸度。以滴定酸度≤50°T为产酸能力弱，以50°T＜滴定酸度≤ 60°T为产酸能力中等，以滴定酸度＞60°T为产酸能力强。

所述的产粘能力是指菌株在发酵乳中产生胞外多糖(expolysaccharide， EPS)的能力，具体检测判断方法为：将菌株培养至对数生长期或稳定期，按 2％(质量百分比)的接种量接种发酵质量百分数为12％的灭菌还原脱脂乳，42℃ 发酵12小时，酸奶样品中加入等体积20％(质量体积比)的三氯乙酸，100℃ 加热5min，3,700×g离心10min，去上清，沉淀用0.5倍体积10％的三氯乙 酸悬浮，再次离心，得多糖粗品。用葡萄糖制作标准曲线，多糖含量用硫酸苯 酚法测定。采用文献中方法：Robitaille G.,et al.Fat-free yogurt made using a galactose-positive expolysaccharide-producing recombinantstrain of Streptococcus thermophilus.J Dairy Sci.92:477-482(2009)，以胞外多糖含量≤80mg/L为产多 糖能力弱，以80mg/L＜胞外多糖含量≤110mg/L为产多糖能力中等，以胞外多 糖含量＞110mg/L为产多糖能力强。

所述的抗噬菌体能力，是指长期在发酵乳制品中应用但在生产环境中，其 所制作的产品中不能分离到侵染这一菌株的噬菌体，一般地，这些菌株具溶原 性、吸附抑制、质粒修饰系统、流产感染、或规律间隔的短回文重复序列 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)等噬菌体抗 性机制。不具备噬菌体抗性的菌株即为噬菌体敏感菌株，指在发酵乳制品生产 过程中易受噬菌体侵染的菌株，在生产环境中，其发酵产品中能分离到其噬菌 体。

所述的噬菌体模式不同，是指噬菌体侵染宿主有其菌株特异性。某一噬菌 体e能侵染嗜热链球菌菌株C，但这一噬菌体e不能侵染另一嗜热链球菌菌株 D；同样的，能侵染嗜热链球菌菌株D的噬菌体f也不能侵染嗜热链球菌菌株C， 这样的菌株C和D即为噬菌体模式不同的菌株。

所述生产性能互补，是指同一生产性能至少有一菌株表现中等或强，产酸 能力达到滴定酸度＞50°T，产粘能力达到产胞外多糖含量＞80mg/L。

嗜热链球菌菌株生产性能检测参照上述标准，例如某一嗜热链球菌菌株产 酸性能为滴定酸度＞50°T，具备噬菌体抗性，另一菌株产粘性能为其产胞外多 糖含量＞80mg/L，具备噬菌体抗性，则两菌株组合成本发明的嗜热链球菌。或 者，某一嗜热链球菌菌株产酸性能为滴定酸度＞50°T，为噬菌体敏感菌株，另 一菌株产粘性能为产胞外多糖含量＞80mg/L，为噬菌体敏感菌株，两菌株对应 的噬菌体不同，则该两菌株组合成本发明的嗜热链球菌。

作为一种优选技术方案，上述酸奶发酵乳酸菌组合中，所述嗜热链球菌与 保加利亚乳杆菌的菌数含量比为100:1～1:1。

作为一种优选技术方案，上述酸奶发酵乳酸菌组合中，两株不同的嗜热链 球菌菌数含量比为2:1～1:2。

作为一种优选技术方案，上述酸奶发酵乳酸菌组合中，所述嗜热链球菌选 自：St1和StBody3的组合；St9和StBody3的组合；St1和St9的组合；S41和 QH-11的组合；S41和St1的组合；S41和St9的组合；QH-11和St9的组合； 或QH-11和St Body3的组合。

St1：S.thermophilus St1，参考文献[Chengjie Ma et al，Geographical diversity ofStreptococcus thermophilus phages in Chinese yoghurt plants，International Dairy Journal，2014，35：32-37]；

St9：S.thermophilus St9，参考文献[Chengjie Ma et al，Geographical diversity of Streptococcus thermophilus phages in Chinese yoghurt plants，International Dairy Journal，2014，35：32-37]；

StBody3：参考文献[中国专利公开号102715234A]；

S41：Streptococcus thermophilusST-1，参考文献[齐沙沙等，产粘乳酸球菌 的筛选与鉴定，乳业科学与技术，2011，1：1-5页]；

QH-11：Streptococcus thermophilusST-2，参考文献[齐沙沙等，产粘乳酸球 菌的筛选与鉴定，乳业科学与技术，2011，1：1-5页]。

作为一种优选技术方案，上述酸奶发酵乳酸菌组合中，所述保加利亚乳杆 菌为保加利亚乳杆菌LB340或保加利亚乳杆菌LBCH-1。

作为一种优选技术方案，上述酸奶发酵乳酸菌组合，由嗜热链球菌菌株 S-41、嗜热链球菌菌株QH-11和保加利亚乳杆菌LBCH-1组成。

最佳地，上述酸奶发酵乳酸菌组合，嗜热链球菌菌株S-41、嗜热链球菌菌 株QH-11和保加利亚乳杆菌LBCH-1的菌数含量比为20:10:1。

本发明还提供上述酸奶发酵乳酸菌组合的使用方法，是发酵接种量为10⁶～ 10⁷cfu/mL。即每毫升原料乳接种10⁶～10⁷cfu上述酸奶发酵乳酸菌组合。

本发明还提供一种直投式酸奶发酵剂，包括以上任一所述的酸奶发酵乳酸 菌组合。

本发明技术方案中用到的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌株，均为现有已 知菌株，公众可以通过商业途径或从申请人处获得。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和积极效果：

1、发酵剂生产性能稳定、实用性强

噬菌体有着很快的繁殖速度，生产环境中的噬菌体难以灭菌干净，噬菌体 污染一直是困扰着酸奶、奶酪发酵的一大世界性难题。本发明通过嗜热链球菌 噬菌体敏感菌株与噬菌体抗性菌株组合或不同噬菌体模式的嗜热链球菌组合， 使发酵剂生产性能良好、稳定，较好地克服了生产环境中的噬菌体污染，实用 性强。

2、发酵剂生产性能良好、产品菌数含量高

含单一嗜热链球菌敏感菌株的发酵剂其在实际生产中如受噬菌体侵染，将 导致敏感菌株裂解、球杆菌共生关系受破坏，产品中菌数含量大幅下降、产品 益生功能降低。本发明通过产酸产粘好、产酸快菌株的复配使用，达到了发酵 剂良好的口感、粘度、风味以及发酵时间较短等目标。

3、能根据生产需要设计不同生产性能酸奶发酵剂

本发明提供了一种多组分酸奶发酵剂设计方案，实际生产上可根据噬菌体 存在情况、噬菌体类型、所需产品粘度、期望的发酵时间等对多组分酸奶发酵 剂中的具体菌株、菌株比例等进行调节，满足实际生产需求。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以 更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

一、下述实施例中，原料及其来源：

1、脱脂乳：生牛乳离心脱脂或脱脂乳粉按12～15％(质量百分比)还原制 得，脱脂乳粉来源于新西兰恒天然公司；

2、生牛乳：来源于武汉光明乳品有限公司；

3、M17培养基：购自于德国的Merck公司；

4、MRS培养基：购自于德国的Merck公司；

5、嗜热链球菌菌株St1、St9：St1(S.thermophilus St1)分离纯化自丹麦丹 尼斯克公司(Danisco Company)DVS-A直投式酸奶发酵剂，为产酸能力和产多 糖能力强、产香能力中等、对噬菌体敏感的嗜热链球菌菌株；菌株St9(S. thermophilus St9)分离纯化自丹麦科·汉森公司(Chr.Hansen Company)DVS-B 直投式酸奶发酵剂，为产酸与产多糖能力较强、产香能力好、对噬菌体敏感的 嗜热链球菌菌株。参考文献[Chengjie Ma et al，Geographical diversity of Streptococcus thermophilus phages in Chinese yoghurt plants，International Dairy Journal，2014，35：27-32]。

6、嗜热链球菌StBody3发酵剂：冷冻干燥浓缩菌粉，含单独的嗜热链球菌 菌株，来源于丹麦科·汉森公司，为产粘能力强、产酸缓慢菌株，在长期实际生 产中未发现其受噬菌体侵染，认为其为噬菌体抗性菌株，简称StBody3。参考 文献[中国专利公开号102715234A]。

7、嗜热链球菌菌株S-41、QH-11：分离自内蒙古、青海农家自制发酵乳制 品，由光明乳业技术中心鉴定、保藏。菌株QH-11为产酸能力强、产粘能力稍 差、香气中等，具备噬菌体抗性菌株，简称QH-11；菌株S-41为产粘能力强、 产酸能力稍差、香气浓郁，具备噬菌体抗性菌株，简称S-41。参考文献[齐沙沙 等，产粘乳酸球菌的筛选与鉴定，乳业科学与技术，2011，1：1-5页]。

8、保加利亚乳杆菌LB340、LBCH-1：LB340购自丹尼斯克公司、LBCH-1 购自丹麦科·汉森公司，简称LB340、LBCH-1。

9、直投式酸奶发酵剂DVS-A、DVS-B：DVS-A购自丹尼斯克公司、DVS-B 购自科·汉森公司，DVS-A、DVS-B均为含1株嗜热链球菌、1株保加利亚乳杆 菌的酸奶发酵剂。

10、嗜热链球菌噬菌体为以嗜热链球菌菌株St1为指示 菌，分离自市售酸奶产品，cos-型包装机制，St1的烈性噬菌体，简称以嗜热链球菌菌株St9为指示菌，分离自市售酸奶产品，pac-型包装机制，St9 的烈性噬菌体，简称参考文献[Chengjie Ma et al，Geographical diversity of Streptococcus thermophilus phages in Chinese yoghurt plants，International Dairy Journal，2014，35：27-32]。

11、白砂糖、海藻糖、甘油：食品级原料，市售。

表1 嗜热链球菌不同菌株生产性能

St1 St9 StBody3 S-41 QH-11 产酸能力(酸度，°T) 66 62 45 48 63 产粘能力(胞外多糖含量，mg/L) 120 112 123 118 69 噬菌体敏感或抗性 敏感 敏感 抗性 抗性 抗性

注：产酸能力和产粘能力检测判断方法均为本发明所述方法。

二、所涉及的实验测定方法

1、滴定酸度：采用国家标准《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》 (GB5413.34-2010)，以酚酞为指示液，用0.1000mol/L氢氧化钠标准溶液滴定 100g试样至终点所消耗的氢氧化钠溶液体积，经计算确定试样的酸度。取10g 酸奶，加入到20mL蒸馏水中，同时滴加0.5％酚酞(即0.5％酚酞乙醇溶液， 配制方法为：取0.5g酚酞，用乙醇溶解，并稀释至100mL体积浓度为95％的 乙醇中)2mL，以0.1mol/L的NaOH滴定至粉红色，滴定体积(mL)乘以10 即为该发酵乳的滴定酸度值，用吉尔涅尔度°T表示。

2、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等菌数含量检测：按《食品安全国家标准 食品微生物学检验乳酸菌检验》(GB4789.35-2010)方法进行。

3、胞外多糖含量：按照以下文献中方法进行：[RobitailleG.,et al.Fat-free yogurt made using a galactose-positive expolysaccharide-producing recombinant strain of Streptococcus thermophilus.JDairySci.92:477-482(2009)]。

4、酸奶产品粘度测定：按照以下文献中方法进行：[齐沙沙等，产粘乳酸 球菌的筛选与鉴定，乳业科学与技术，2011，1：1-5]。

5、噬菌体包装机制鉴定：参考文献[徐志平等，嗜热链球菌噬菌体的分离 纯化与鉴定，食品工业科技，2014，35(1)：141-143]。

实施例1

(1)发酵剂菌株培养与计数

将保藏的嗜热链球菌菌株St1、StBody3、保加利亚乳杆菌菌株LBCH-1经 2～3次液体活化培养后，St1、StBody3分别接入M17液体培养基，42℃培养 18hrs，LBCH-1接入MRS培养基，42℃培养24hrs，计数菌数含量。

(2)菌株组合与发酵剂

根据液体培养的菌数含量，将St1、StBody3、LBCH-1按50:50:1(菌数含 量)混合，形成多组分发酵剂培养物。无菌条件下，5000rpm、5min离心沉淀 菌体，去除上清培养基成分。

(3)发酵剂应用与酸奶制作

12％(质量百分比)还原的脱脂乳经95℃、5min保温杀菌后冷却至42℃， 按发酵剂总菌数含量3×10⁶cfu/mL接入上述多组分发酵剂，并模拟实际生产情 况，加入1×10²pfu/mL的嗜热链球菌噬菌体42℃恒温发酵至滴定酸度 75°T。

本实施例，产品到达终点酸度时间为345min，产品口感细腻滑爽、组织状 态良好、几乎无乳清析出、具发酵乳特有发酵风味。产品粘度为0.375Pa·s，多 糖含量141mg/L，其保加利亚乳杆菌菌数含量为2.3×10⁸cfu/g，嗜热链球菌菌数 含量为1.4×10⁹cfu/g。

对比实施例1-1

(1)发酵剂菌株培养与计数

将保藏的嗜热链球菌菌株St1、保加利亚乳杆菌菌株LBCH-1经2～3次液 体活化培养后，St1接入M17液体培养基，42℃培养18hrs，LBCH-1接入MRS 培养基，42℃培养24hrs，计数菌数含量；

(2)菌株组合与发酵剂

根据液体培养的菌数含量，将St1、LBCH-1按100:1(菌数含量)混合，形 成两组分发酵剂培养物。无菌条件下，5000rpm、5min离心沉淀菌体，去除上 清培养基成分。

(3)发酵剂应用与酸奶制作

12％(质量百分比)还原的脱脂乳经95℃、5min保温杀菌后冷却至42℃， 按发酵剂总菌数含量3×10⁶cfu/mL接入上述两组分发酵剂，并模拟实际生产情 况，加入1×10²pfu/mL的嗜热链球菌噬菌体42℃恒温发酵至滴定酸度 75°T。

本对比实施例，产品到达终点酸度时间为630min，产品口感粗糙、稀薄、 有较多乳清析出。产品粘度为0.173Pa·s，多糖含量68mg/L，其保加利亚乳杆菌 菌数含量为1.5×10⁸cfu/g，嗜热链球菌菌数含量为1.9×10⁶cfu/g。与实施例1比较， 含1株保加利亚乳杆菌、1株嗜热链球菌敏感菌株的两组分发酵剂在实际生产环 境存在噬菌体条件下发酵，发酵时间明显延长，产品口感粗糙、粘度差、终产 品中乳酸菌菌数显著降低。

对比实施例1-2

(1)直投式发酵剂计数

将直投式发酵剂DVS-A梯度稀释后，计数菌数含量；

(2)发酵剂应用与酸奶制作

12％(质量百分比)还原的脱脂乳经95℃、5min保温杀菌后冷却至42℃， 按发酵剂总菌数含量3×10⁶cfu/mL接入直投式发酵剂DVS-A，并模拟实际生产 情况，加入1×10²pfu/mL的嗜热链球菌噬菌体42℃恒温发酵至滴定酸度 75°T。

本对比实施例，产品到达终点酸度时间为690min，产品口感粗糙、稀薄、 有较多乳清析出。产品粘度为0.186Pa·s，多糖含量79mg/L，其保加利亚乳杆菌 菌数含量为2.1×10⁸cfu/g，嗜热链球菌菌数含量为4.6×10⁶cfu/g。与实施例1比较， 含1株保加利亚乳杆菌、1株嗜热链球菌敏感菌株的商业直投式两组分发酵剂在 实际生产环境存在噬菌体条件下发酵，也出现发酵时间明显延长，产品口感粗 糙、粘度差、终产品中乳酸菌菌数显著降低等状况。

实施例2

(1)发酵剂菌株培养与计数

将保藏的嗜热链球菌菌株St9、StBody3、保加利亚乳杆菌菌株LB340经2～ 3次液体活化培养后，St9、StBody3分别接入M17液体培养基，39℃培养12hrs， LB340接入MRS培养基，39℃培养18hrs，计数菌数含量；

(2)菌株组合与发酵剂

根据液体培养的菌数含量，将St9、StBody3、LB340按5:5:1(菌数含量) 混合，形成多组分发酵剂培养物。无菌条件下，5000rpm、5min离心沉淀菌体， 去除上清培养基成分。

(3)发酵剂应用与酸奶制作

无抗生素残留新鲜牛乳乳经95℃、5min保温杀菌后冷却至42℃，按发酵剂 总菌数含量1×10⁶cfu/mL接入上述多组分发酵剂，并模拟实际生产情况，加入 1×10²pfu/mL的嗜热链球菌噬菌体42℃恒温发酵至滴定酸度75°T。

本实施例，产品到达终点酸度时间为375min，产品口感细腻滑爽、组织状 态良好、几乎无乳清析出、具发酵乳特有发酵风味。产品粘度为0.368Pa·s，多 糖含量133mg/L，其保加利亚乳杆菌菌数含量为3.7×10⁸cfu/g，嗜热链球菌菌数 含量为1.6×10⁹cfu/g。

对比实施例2-1

(1)发酵剂菌株培养与计数

将保藏的嗜热链球菌菌株St9、保加利亚乳杆菌菌株LB340经2～3次液体 活化培养后，St9接入M17液体培养基，39℃培养12hrs，LB340接入MRS 培养基，39℃培养18hrs，计数菌数含量；

(2)菌株组合与发酵剂

根据液体培养的菌数含量，将St9、LB340按10:1(菌数含量)混合，形成 两组分发酵剂培养物。无菌条件下，5000rpm、5min离心沉淀菌体，去除上清 培养基成分。

(3)发酵剂应用与酸奶制作

无抗生素残留新鲜牛乳乳经95℃、5min保温杀菌后冷却至42℃，按发酵剂 总菌数含量1×10⁶cfu/mL接入上述多组分发酵剂，并模拟实际生产情况，加入 1×10²pfu/mL的嗜热链球菌噬菌体42℃恒温发酵至滴定酸度75°T。

本对比实施例，产品到达终点酸度时间为645min，产品口感粗糙、稀薄、 有较多乳清析出。产品粘度为0.168Pa·s，多糖含量71mg/L，其保加利亚乳杆菌 菌数含量为1.3×10⁸cfu/g，嗜热链球菌菌数含量为2.6×10⁶cfu/g。与实施例2比较， 含1株保加利亚乳杆菌、1株嗜热链球菌敏感菌株的两组分发酵剂在实际生产环 境存在噬菌体条件下发酵，发酵时间明显延长，产品口感粗糙、粘度差、终产 品中乳酸菌菌数显著降低。

对比实施例2-2

(1)直投式发酵剂计数

将直投式发酵剂DVS-B梯度稀释后，计数菌数含量；

(2)发酵剂应用与酸奶制作

12％(质量百分比)还原的脱脂乳经95℃、5min保温杀菌后冷却至42℃， 按发酵剂总菌数含量3×10⁶cfu/mL接入直投式发酵剂DVS-B，并模拟实际生产 情况，加入1×10²pfu/mL的嗜热链球菌噬菌体42℃恒温发酵至滴定酸度 75°T。

本对比实施例，产品到达终点酸度时间为690min，产品口感粗糙、稀薄、 有较多乳清析出。产品粘度为0.186Pa·s，多糖含量76mg/L，其保加利亚乳杆菌 菌数含量为2.1×10⁸cfu/g，嗜热链球菌菌数含量为4.6×10⁶cfu/g。与实施例2比较， 含1株保加利亚乳杆菌、1株嗜热链球菌敏感菌株的商业直投式两组分发酵剂在 实际生产环境存在噬菌体条件下发酵，也出现发酵时间明显延长，产品口感粗 糙、粘度差、终产品中乳酸菌菌数显著降低等生产异常。

实施例3

(1)发酵剂菌株培养与计数

将保藏的嗜热链球菌菌株St1、St9、保加利亚乳杆菌菌株LB340经2～3 次液体活化培养后，St1、St9分别接入M17液体培养基，42℃培养18hrs，LB340 接入MRS培养基，42℃培养24hrs，计数菌数含量；

(2)菌株组合与发酵剂

根据液体培养的菌数含量，将St1、St9、LB340按1:1:2(菌数含量)混合， 形成多组分发酵剂培养物。无菌条件下，5000rpm、5min离心沉淀菌体，去除 上清培养基成分，并添加甘油、海藻糖作保护剂，通过冷冻干燥制成冷冻浓缩 干燥菌粉直投式发酵剂。

(3)发酵剂应用与酸奶制作

920千克的无抗生素残留新鲜牛乳中添加80千克白砂糖，经65℃、20MPa 均质，95℃、5min保温杀菌后冷却至42℃已预杀菌的发酵缸中，按发酵剂总菌 数含量5×10⁶cfu/mL接入上述多组分发酵剂(经分析检测，该生产工厂环境中 存在噬菌体，但不存在噬菌体)，42℃恒温发酵至滴定酸度75°T。

本实施例，产品到达终点酸度时间为330min，产品口感细腻滑爽、组织状 态良好、几乎无乳清析出、具发酵乳特有发酵风味。产品粘度为0.286Pa·s，多 糖含量159mg/L，其保加利亚乳杆菌菌数含量为3.1×10⁸cfu/g，嗜热链球菌菌数 含量为7.9×10⁸cfu/g。

对比实施例3-1

(1)发酵剂菌株培养与计数

将保藏的嗜热链球菌菌株St1、保加利亚乳杆菌菌株LB340经2～3次液体 活化培养后，St1接入M17液体培养基，42℃培养18hrs，LB340接入MRS培 养基，42℃培养24hrs，计数菌数含量；

(2)菌株组合与发酵剂

根据液体培养的菌数含量，将St1、LB340按1:1(菌数含量)混合，形成 多组分发酵剂培养物。无菌条件下，5000rpm、5min离心沉淀菌体，去除上清 培养基成分，并添加甘油、海藻糖作保护剂，通过冷冻干燥制成冷冻浓缩干燥 菌粉直投式发酵剂。

(3)发酵剂应用与酸奶制作

920千克的无抗生素残留新鲜牛乳中添加80千克白砂糖，经65℃、20MPa 均质，95℃、5min保温杀菌后冷却至42℃已预杀菌的发酵缸中，按发酵剂总菌 数含量5×10⁶cfu/mL接入上述多组分发酵剂(经分析检测，该生产工厂环境中 存在噬菌体)，42℃恒温发酵至滴定酸度75°T。

本实施例，产品到达终点酸度时间为660min，产品口感粗糙、稀薄、有较 多乳清析出。产品粘度为0.121Pa·s，多糖含量63mg/L，其保加利亚乳杆菌菌数 含量为1.6×10⁸cfu/g，嗜热链球菌菌数含量为1.3×10⁶cfu/g。与实施例3比较，含1 株保加利亚乳杆菌、1株嗜热链球菌敏感菌株的两组分发酵剂在实际生产环境存 在噬菌体条件下发酵，发酵时间明显延长，产品口感粗糙、粘度变差，终产品 中乳酸菌菌数显著降低。

实施例4

(1)发酵剂菌株培养与计数

将保藏的嗜热链球菌菌株S41、QH-11、保加利亚乳杆菌菌株LBCH-1经2～ 3次液体活化培养后，S41、QH-11、LBCH-1分别接入12％还原的灭菌脱脂乳 中，42℃发酵12hrs，计数菌数含量；

(2)菌株组合与发酵剂

根据菌数含量，将S41、QH-11、LBCH-1按20:10:1(菌数含量)比例取单 菌株发酵培养物，混合均匀，形成多组分发酵剂培养物。

(3)发酵剂应用与酸奶制作

无抗生素残留新鲜牛乳经65℃、20MPa均质，95℃、5min保温杀菌后冷却 至42℃，按发酵剂总菌数含量3×10⁶cfu/mL接入上述多组分发酵剂，42℃恒温 发酵至滴定酸度75°T。

本实施例，产品到达终点酸度时间为315min，产品口感细腻滑爽、组织状 态良好、几乎无乳清析出、具发酵乳特有发酵风味。产品粘度为0.372Pa·s，多 糖含量148mg/L，其保加利亚乳杆菌菌数含量为5.1×10⁸CFU/g，嗜热链球菌菌 数含量为3.2×10⁹CFU/g。

对比实施例4-1

(1)发酵剂菌株培养与计数

将保藏的嗜热链球菌菌株S-41、保加利亚乳杆菌菌株LBCH-1经2～3次 液体活化培养后，S-41、LBCH-1分别接入12％还原的灭菌脱脂乳中，42℃发 酵12hrs，计数菌数含量；

(2)菌株组合与发酵剂

根据菌数含量，将S-41、LBCH-1按30:1(菌数含量)比例取单菌株发酵 培养物，混合均匀，形成两组分发酵剂培养物。

(3)发酵剂应用与酸奶制作

无抗生素残留新鲜牛乳经65℃、20MPa均质，95℃、5min保温杀菌后冷却 至42℃，按发酵剂总菌数含量3×10⁶CFU/mL接入上述多组分发酵剂，42℃恒 温发酵至滴定酸度75°T。

本对比实施例，产品到达终点酸度时间为450min，产品口感细腻滑爽、组 织状态良好、几乎无乳清析出、具发酵乳特有发酵风味。产品粘度为0.375Pa·s， 多糖含量143mg/L，其保加利亚乳杆菌菌数含量为6.4×10⁸CFU/g，嗜热链球菌 菌数含量为2.1×10⁹CFU/g。与实施例4比较，本对比实施例产品组织状态、口 感风味、粘度、多糖含量相当、差异不大，但发酵时间明显长于对比实施例4， 在实际生产中，生产效率较低。

对比实施例4-2

(1)发酵剂菌株培养与计数

将保藏的嗜热链球菌菌株QH-11、保加利亚乳杆菌菌株LBCH-1经2～3 次液体活化培养后，QH-11、LBCH-1分别接入12％还原的灭菌脱脂乳中，42℃ 发酵12hrs，计数菌数含量；

(2)菌株组合与发酵剂

根据菌数含量，将QH-11、LBCH-1按30:1(菌数含量)比例取单菌株发酵 培养物，混合均匀，形成两组分发酵剂培养物。

(3)发酵剂应用与酸奶制作

无抗生素残留新鲜牛乳经65℃、20MPa均质，95℃、5min保温杀菌后冷却 至42℃，按发酵剂总菌数含量3×10⁶CFU/mL接入上述多组分发酵剂，42℃恒 温发酵至滴定酸度75°T。

本对比实施例，产品到达终点酸度时间为305min，但产品口感较为稀薄、 不够细腻滑爽、有少量乳清析出。产品粘度为0.216Pa·s，多糖含量92mg/L，其 保加利亚乳杆菌菌数含量为3.9×10⁸CFU/g，嗜热链球菌菌数含量为9.4×10⁸ CFU/g。与实施例4比较，本对比实施例虽发酵时间略短，但产品组织状态、粘 度、多糖含量等均不如实施例4。这表明产酸太快的球菌与杆菌组合存在组织状 态方面的缺陷，而实施例4中产粘好、产酸快球菌与杆菌以适当比例组成的三组 分发酵剂则弥补了这方面的缺陷，产品整体发酵时间、组织状态、口感风味较 好。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的 保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或 变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。