产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及作为酸奶发酵剂条件的研究

摘要

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）是一种广泛分布于自然界的非蛋白质氨基酸。在生物体内由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶（Glutamatedecarboxylase，GAD）催化转化而来，是目前研究较深入的一种重要抑制性神经传递物质，参与体内多种代谢活动，具有很多的生理功能，如降血压、改善脑功能、镇静、增强长期记忆及肝、肾机能等功能。含有谷氨酸脱羧酶的乳酸菌也能将谷氨酸转化为GABA，是GABA产生的一个重要途径，本研究的主要目的是选育高产GABA的乳酸菌菌株，研究该菌株应用于酸奶的可行性，并利用动物实验方法确定这种酸奶的降血压作用。
　　 谷氨酸脱羧酶（Glutamatedecarboxylase，GAD）是生物体内催化谷氨酸或其钠盐脱羧生成GABA的唯一酶。本研究通过聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术对供试的64株乳酸菌基因组片段进行扩增，检测是否含有gad基因，同时采用高效液相色谱方法测定菌株GABA的生成量，发现两个结果具有对应关系，即含有gad基因的乳酸菌能代谢产生GABA，不产GABA的乳酸菌也没有gad基因阳性扩增。
　　 从64株乳酸菌中筛选出1株高产GABA的短乳杆菌KLDS1.0727，该菌株的GABA产量为1.98g/L。对该菌株进行紫外诱变处理，获得突变菌株1.0727-19，其GABA产量为3.01g/L。对该突变株再进行亚硝基胍诱变处理，获得一株遗产稳定的高产GABA的突变菌株1.0727-19.1，GABA产量达5.04g/L。
　　 对短乳杆菌1.0727-19-1的GAD的酶学性质进行研究，包括酶的热稳定性、反应最适温度和最适pH，以及一些金属离子和磷酸吡哆醛对酶活力的影响。结果表明：此酶最适温度为37℃，耐热性较差，最适pH为4.3，对底物的Km为57.17mmol/L，金属离子对酶活力有较大影响，其中ca2+、cu2+、Mg2+、Mn2+对酶活力有促进作用，K+、Fe2+有抑制作用，磷酸吡哆醛在低浓度时有一定激活作用，当浓度达到30μmol/L时，随浓度提高反而有抑制作用。
　　 确定添加突变菌株1.0727-19-1生产酸奶的最佳发酵条件：发酵温度为42℃，突变菌株的接种量为106CFU/mL，谷氨酸的添加量为1.5g/L。
　　 采用原发性高血压大鼠（spontaneouslyhypertensiverats，SHR）和Wistar大鼠进行动物实验，研究添加突变菌株1.0727-19-1的酸奶的作用，发现：SHR在灌胃后的6～8h，收缩压达到最低，与对照组相比显著降低（P<0.05），随突变菌株1.0727-19-1添加量的增加，降压效果越明显，连续灌胃4周后高剂量组SHR血压降低了22.7mmHg，差异显著（P<0.05），而Wistar大鼠血压下降不明显（P>0.05），说明该酸奶对正常大鼠的血压没有明显影响。高剂量组SHR心脏血液中ACE活性显著降低，表明抑制ACE活性是GABA降血压机理之一。
　　 本研究得到如下结论：发现含有gad基因的乳酸菌能够产生GABA，而不产GABA的菌株也没有出现gad基因的阳性扩增，具有对应性。通过诱变育种得到一株遗传稳定的高产GABA突变菌株1.0727-19-1，其GABA产量达5.04mg/L；确定了添加该菌株酸奶的发酵条件，高血压大鼠试验表明：该酸奶具有一定降血压功能，本研究对研制和开发富含GABA的功能性乳制品具有一定指导意义。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1 前言

1.1 立题背景

1.2 γ-氨基丁酸综述

1.2.1 γ-氨基丁酸简介

1.2.2 γ-氨基丁酸的主要生理功能

1.2.3 γ-氨基丁酸的制备方法

1.2.4 γ-氨基丁酸的检测方法

1.3 微生物菌株诱变育种的常见方法

1.4 乳酸菌谷氨酸脱羧酶的研究进展

1.4.1 谷氨酸脱羧酶在乳酸菌合成γ-氨基丁酸中的作用

1.4.2 乳酸菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质

1.5 富含γ-氨基丁酸食品的临床试验功效

1.6 本研究的目的与意义

1.7 本研究拟采取的技术路线

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 培养基

2.1.3 实验动物

2.1.4 主要试剂及来源

2.2 仪器与设备

2.3 试验方法

2.3.1 乳酸菌谷氨酸脱羧酶与其产γ-氨基丁酸相关性的研究

2.3.2 产γ-氨基丁酸乳酸菌的诱变育种

2.3.3 高产γ-氨基丁酸突变菌株的谷氨酸脱羧酶性质的研究

2.3.4 添加高产γ-氨基丁酸突变菌株酸奶最佳发酵条件的确定

2.3.5 添加高产γ-氨基丁酸突变菌株酸奶的动物试验

2.3.6 数据处理

3 结果与分析

3.1 乳酸菌谷氨酸脱羧酶与其产γ-氨基丁酸的相关性

3.1.1 乳酸菌DNAr的提取与深度的测定

3.1.2 PCR方法检测乳酸菌中的谷氨酸脱羧酶基因

3.1.3 γ－氨基丁酸标准曲线的建立

3.1.4 乳酸菌γ－氨基丁酸产量的测定

3.2 产γ-氨基丁酸乳酸菌的诱变育种

3.2.1 紫外诱变

3.2.2 亚硝基胍诱变

3.3 高产γ-氨基丁酸突变菌株谷氨酸脱羧酶性质的研究

3.3.1 酶的最适反应温度及热稳定性

3.3.2 酶反应的最适pH

3.3.3 反应产物的生成与反应时间的关系

3.3.4 底物浓度对酶反应速度的影响

3.3.5 金属离子对酶活力的影响

3.3.6 磷酸吡哆醛对酶活力的影响

3.4 添加高产γ-氨基丁酸突变菌株酸奶最佳发酵条件的确定

3.4.1 最佳发酵温度的确定

3.4.2 最佳接种量的确定

3.4.3 谷氨酸最佳添加量的确定

3.4.4 酸奶在储存期间γ－氨基丁酸含量的变化

3.5 添加高产γ-氨基丁酸突变菌株酸奶的动物试验

3.5.1 γ-氨基丁酸对大鼠尾部动脉血压的影响

3.5.2 γ-氨基丁酸对组织内源性血管紧张素转化酶的影响

4 讨论

4.1 产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选

4.2 产γ-氨基丁酸乳酸菌的诱变育种

4.3 乳酸菌谷氨酸脱羧酶酶学性质

4.4 富含γ-氨基丁酸酸奶的降血压作用

5 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文