一种利用不同水解条件制备具有稳定的功能性的酪蛋白酶解物的方法

摘要

一种利用不同水解条件制备具有稳定的功能性的酪蛋白酶解物的方法，属于酪蛋白水解技术加工领域。其首先选定一个底物（酪蛋白）-酶（碱性蛋白酶）作为反应系统，通过pH-stat法控制水解过程pH恒定，在一定的温度(T)、酶底比(E/S)和底物浓度(S)范围内改变这三个水解条件，当水解产物达到既定的水解度（DH）时，灭酶干燥，得到的同一水解度（DH）的水解产物的性质无显著性差异即是稳定的。本发明可以根据不同生产条件进行调整，水解得到同一DH的水解产物，使其具备等同的性质。可以作为指导工业生产的一种方法，有弹性的改变生产条件，仍然能够保证产品的稳定性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用不同的水解温度、酶底比组合制备具有特定功能性质的水解产物的方法，属于酪蛋白水解技术加工领域。

背景技术

蛋白酶是属于水解酶的一种，它主要是水解蛋白质与多肽的肽键。根据酶的来源，蛋白酶可以分成动物来源蛋白酶，植物来源蛋白酶，微生物来源蛋白酶。根据催化的位置的不同，蛋白酶可以分为内肽酶与外肽酶。内肽酶是如今使用较多的酶，内肽酶又可以根据作用的活性位点的不同分为丝氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，金属蛋白酶和天冬酰胺蛋白酶这四种。人类早在几百年前就使用蛋白酶，典型的例子是中国的发酵豆制品。近些年来，蛋白酶由于其众多的优点，越来越被使用在工业生产与实验研究当中。人们越来越多的使用蛋白酶水解各类蛋白质，以期改善其结构与功能，如改善大豆蛋白的乳化性、起泡性、溶解性等；或者制备某些具有如抗氧化性、降血压等特殊生理功能的多肽物质。这些研究往往都是建立在研究不同的酶对某一底物，或者某一种酶对多种底物的作用，水解不同的时间或者达到不同的水解度，以获得优化的水解条件或经优化的水解度。

对于酪蛋白，众所周知，它是奶液遇酸后所生成的一种蛋白聚合体。酪蛋白约占牛奶中蛋白总量的80%，约占其质量的3% ，也是奶酪的主要成分。酪蛋白是等电点为pH4.6的两性蛋白质，是牛乳腺分泌的多种(约20种)磷蛋白(phosphoproteins)的混合物，在牛奶中以磷酸二钙、磷酸三钙或两者的复合物形式存在，构造极为复杂。作为牛乳中一种含量高，构象灵活的混合蛋白质，酪蛋白易被蛋白酶水解，其水解产物主要包括肽、少量氨基酸、糖、维生素等。这些产物具有抗菌抗病和调节胃肠吸收等生理功能，在特定条件下还能促进动物细胞体外增殖、增强产物表达，因此，越来越多的研究者将酪蛋白作为一种酶解底物来制备具有功能性质的多肽。如制备具有抗氧化性的酪蛋白磷酸肽、具有降血压功能的多肽、易被人体吸收的多肽和促进肠道有益菌群的生长繁殖多肽等。

另外东北农业大学食品学院郑丽娜与张兰威研究发现，碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽的最佳水解条件为：底物浓度15%、 酶浓度800μ/g、 pH 9.0、温度55℃、时间2.5h。而蔡为荣与薛正莲碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽的最佳工艺条件：底物浓度10%、用酶量1500μ/g、反应温度45℃、pH10.5、反应时间150min。这些研究者均采用碱性蛋白酶和酪蛋白来制备酪蛋白磷酸肽，但获得的最佳制备条件却差异较大。如何在不同酶解条件下获得性质稳定的酶解物显得颇为重要。

在工业生产中，产品的稳定性更为重要。对于一个既定的酶解系统，影响该过程的主要因素有五个，即：反应温度（T），底物浓度（S），pH，酶底比（E/S），水解度（DH）或水解时间（t）。Alder-Nissen采用了pH-stat法来控制碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白反应过程的pH，在较低的水解度下测定其水解产物的性质，研究不同的水解条件如温度，pH，酶底比和底物浓度对水解产物性质的影响。但在工业生产中，想要完全控制这五个水解条件是存在一定难度的，并且由于生产条件的限制，生产批次的不同往往不能够保证每次的水解条件都一样。因此，在有弹性的生产条件下，获得稳定功能与性质的水解产物是相当重要的。

目前针对该方面的研究不多，本发明希望能够为工业生产作指导，以在不同的温度-酶底比组合下都能够获得具有稳定功能性质的酶解产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种可在不同的水解条件下制备具有稳定的功能与性质的酪蛋白水解产物的制备方法。

本发明的技术方案，以酪蛋白为原料，选择在不同的水解条件下水解，控制其水解，在每一个水解条件下均得到水解度为5%，10%及15%的水解产物。使得在同一水解度下，不同条件得到的水解产物的三氯乙酸（TCA）可溶性氮含量，DPPH清除率分别都不呈现显著性差异（P<0.05），具体来说，所得酪蛋白酶解物粉末性质是稳定的。其步骤为：

（1）配制酶解底物：取酪蛋白，用10-15倍质量的蒸馏水溶胀，采用0.5M 的NaOH溶液调节pH值至8.5±0.1，直至pH值恒定，再用蒸馏水定量，使酪蛋白的最终质量浓度为4%-8%，即得酶解底物；

（2）酶解：取步骤（1）制备的酶解底物置于酶反应器中，控制温度为40-60℃，进行循环水浴5min；将碱性蛋白酶加入酶解底物中，使酶与底物蛋白质量比为1%-3%；酶解过程中，通过加入碱溶液来维持反应的pH为8.5±0.1；

（3）灭酶：当水解度达到5%-15%中的一个固定值时，95oC加热10min灭酶；

（4）冷却：步骤（3）灭酶后的水解液经冷却，干燥得到淡黄或者乳白色的酪蛋白酶解物粉末。

步骤（2）所述碱溶液为0.1M的碱溶液。

所得酪蛋白酶解物粉末性质稳定，具体测试结果如下：

（1）比较同一水解度下的水解产物的TCA可溶性氮含量的差异性，在显著性水平为p>0.05时，差异性不显著。

（2）比较同一水解度下的水解产物的DPPH清除率的差异性，在显著性水平为p>0.05时，差异性不显著。

（3）比较同一水解度下的水解产物的分子量分布（SEC-HPLC），在分子量大于10kD、1-10kD、0.5-1kD与小于0.5kD这四个区间的水解产物分子量分布百分比与参照组条件下的值相比，偏差在5%以内，E/S=1/100,T=50℃作参照组。

分析方法：

1、pH-stat法控制水解反应，计算水解度的方法如下： 

 式中：B-消耗标准碱的体积（mL）；

      N_b-标准碱的浓度（mol/L）;

α-α氨基的解离度

M_p-底物中蛋白质的含量（g）；

h_tot-单位质量蛋白质的肽键总数(mmol/g)，对于酪蛋白h_tot=8.2mmol/g。

2、氮含量的测定：半微量凯氏定氮法 (GB 5009.5—1985)。

3、三氯乙酸（TCA）可溶性氮含量：采用三氯乙酸法测定水解产物的溶解性。具体操作步骤为：称取冻干样品 2.0g，加入 15%三氯乙酸(TCA)溶液 10mL，混合均匀。静置 5min 后，将溶液定量转移，在 4000r/min 下离心 10min 后，取全部上清液。采用凯氏定氮法测定含氮量，（酪蛋白蛋白质换算系数为 6.38）。计算公式如下：

4、DPPH清除率：取一定浓度的样品溶液4mL，加入1mL用甲醇配制的DPPH溶液, 并使DPPH终浓度为0.2mmol/L。用力振摇混匀后置暗室中静置30min，于517nm下测定吸光度。按下式计算DPPH清除率。

式中:A_x 为加入样品溶液后的吸光度，A_x0为样品溶液本底的吸光度，A₀ 为空白对照液的吸光度。

5、水解产物的分子量分布进行测定。具体操作步骤为：用流动相配置样品溶液10mg/mL，经孔径0.22μm的醋酸纤维素膜过滤后，用高效液相色谱仪，用紫外检测器进行检测。同时配置肽标准品溶液，过膜后进样，制作相对分子质量校正曲线，肽标准品分别为：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（451Da），杆菌酶（1450Da）、细胞色素C（12500Da）。色谱条件为：色谱柱：TSKgel G2000SWXL，300mm*7.8mm；流动相：乙腈︰水︰三氟乙酸=45︰55︰0.1；流速：0.5mL/min；进样量：20μL；检测波长：220nm；柱温：30℃，信号采集时间30min。

本发明的有益效果：本发明可以根据不同生产条件进行调整，酪蛋白水解得到同一DH的酪蛋白水解产物，使其具备等同的性质。本发明可以指导工业生产，通过有弹性的改变生产条件，仍然能够保证产品的稳定性。

附图说明

图1酪蛋白水解度5%的分子量分布图。

图2酪蛋白水解度10%的分子量分布图。

图3酪蛋白水解度15%的分子量分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明，其具体实施例应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下列举例说明来限定本发明的保护范围。

实施例1

酪蛋白底物质量浓度为5%，通过循环水浴锅控制水解温度为50±0.2℃，按酶与底物蛋白的比（E/S）1/100，加入碱性蛋白酶，通过加入0.1M的标准碱控制pH为8.5±0.1，达到相应的水解度（DH），95oC加热10min灭酶，干燥，得到酶解物产品。在该条件下制备水解度分别是5%，10%和15%的水解产物。测定DH5%，10%和15%的TCA可溶性氮含量分别为54.36%，64.31%和75.34%，DPPH清除率分别为34.77%，53.62%和69.78%。

实施例2

酪蛋白底物质量浓度为5%，通过循环水浴锅控制水解温度为50±0.2℃，按酶与底物蛋白的比（E/S）2/100，加入碱性蛋白酶，通过加入0.1M的标准碱控制pH为8.5±0.1，达到相应的水解度（DH），95oC加热10min灭酶，干燥，得到酶解物产品。在该条件下制备水解度分别是5%，10%和15%的水解产物。水解产物冷却冻干，得到产品。测定DH5,10和15%的TCA可溶性氮含量分别为54.43%，64.70%和76.40%，DPPH清除率分别为33.88%，54.49%和69.48%。

实施例3

酪蛋白底物质量浓度为5%，通过循环水浴锅控制水解温度为50±0.2℃，按酶与底物蛋白的比（E/S）3/100，加入碱性蛋白酶，通过加入0.1M的标准碱控制pH为8.5±0.1，达到相应的水解度（DH），95oC加热10min灭酶，干燥，得到酶解物产品。在该条件下制备水解度分别是5%，10%和15%的水解产物。水解产物冷却冻干，得到产品。测定DH5%、10%和15%的TCA可溶性氮含量分别为53.77%，64.48%和76.1%，DPPH清除率分别为33.89%，54.42%和69.15%。

实施例4

酪蛋白底物质量浓度为5%，通过循环水浴锅控制水解温度为60±0.2℃，按酶与底物蛋白的比（E/S）1/100，加入碱性蛋白酶，通过加入0.1M的标准碱控制pH为8.5±0.1，达到相应的水解度（DH），95oC加热10min灭酶，干燥，得到酶解物产品。在该条件下制备水解度分别是5%，10%和15%的水解产物。水解产物冷却冻干，得到产品。测定DH5%、10%和15%的TCA可溶性氮含量分别为54.12%，63.96%和75.54%，DPPH清除率分别为34.60%，54.14%和69.67%。

实施例5

酪蛋白底物质量浓度为5%，通过循环水浴锅控制水解温度为60±0.2℃，按酶与底物蛋白的比（E/S）2/100，加入碱性蛋白酶，通过加入0.1M的标准碱控制pH为8.5±0.1，达到相应的水解度（DH），95oC加热10min灭酶，干燥，得到酶解物产品。测定DH5%、10%和15%的TCA可溶性氮含量分别为55.06%，64.46%和77.53%，DPPH清除率分别为35.01%，54.08%和70.10%。

实施例6

酪蛋白底物质量浓度为5%，通过循环水浴锅控制水解温度为60±0.2℃，按酶与底物蛋白的比（E/S）3/100，加入碱性蛋白酶，通过加入0.1M的标准碱控制pH为8.5±0.1，达到相应的水解度（DH），95oC加热10min灭酶，干燥，得到酶解物产品。测定DH5%、10%和15%的TCA可溶性氮含量分别为54.12%，64.23%和78.92%，DPPH清除率分别为34.57%，54.23%和70.47%。

对照实施例1

酪蛋白底物质量浓度为5%，通过循环水浴锅控制水解温度为70±0.2℃，按酶与底物蛋白的比（E/S）1/100，加入碱性蛋白酶，通过加入0.1M的标准碱控制pH为8.5±0.1，达到相应的水解度（DH），95oC加热10min灭酶，干燥，得到酶解物产品。测定DH5%、10%和15%的TCA可溶性氮含量分别为44.97%，63.80%和63.13%，DPPH清除率分别为30.16%，53.52%和56.67%。

对照实施例2

酪蛋白底物质量浓度为5%，通过循环水浴锅控制水解温度为70±0.2℃，按酶与底物蛋白的比（E/S）2/100，加入碱性蛋白酶，通过加入0.1M的标准碱控制pH为8.5±0.1，达到相应的水解度（DH），95oC加热10min灭酶，干燥，得到酶解物产品。测定DH5%、10%和15%的TCA可溶性氮含量分别为49.33%，64.40%和72.13%，DPPH清除率分别为37.93%，54.03%和64.62%。

对照实施例3

酪蛋白底物质量浓度为5%，通过循环水浴锅控制水解温度为70±0.2℃，按酶与底物蛋白的比（E/S）3/100，加入碱性蛋白酶，通过加入0.1M的标准碱控制pH为8.5±0.1，达到相应的水解度（DH），95oC加热10min灭酶，干燥，得到酶解物产品。测定DH5%、10%和15%的TCA可溶性氮含量分别为50.02%，63.39%和71.65%，DPPH清除率分别为37.62%，54.00%和63.34%。

从对照实施例1-3可以看出，在控制水解温度为70±0.2℃时得到的水解产物的三氯乙酸（TCA）可溶性氮含量，DPPH清除率都有显著性差异的（P≥0.05），所得酪蛋白酶解物粉末性质较不稳定。

实施例7 不同水解条件下制备的水解产物的稳定性评价。

水解产物的稳定性是通过考察不同温度-酶底比组合下得到的同一水解度的水解产物的性质是否有显著性差异。TCA可溶性氮含量与DPPH清除率通过SPSS软件做方差分析（p<0.05），结果见表1。T=50℃，E/S=1/100条件下得到的水解产物做参照组。

同一水解度下，水解产物性质的方差分析（F-test）结果 黑体带*的结果为显著性差异（p<0.05）。E/S=1/100,T=50℃作对照组，F_0.05（1,2）=18.5，若F>18.5则说明在a=0.05的显著性水平下，有显著性差异。

表1

不同酶解条件下制备的水解产物的分子量分布与参照组对比，同一水解度的水解产物的分子量分布（SEC-HPLC），在分子量大于10kD、1-10kD、0.5-1kD与小于0.5kD这四个区间的水解产物分子量分布百分比与参照组条件下的值相比，偏差在5%以内。不同DH的分子量分布如图1~3所示，其中酪蛋白水解度5%的分子量分布如图1所示，酪蛋白水解度10%的分子量分布如图2所示，酪蛋白水解度15%的分子量分布如图3所示。