假交替单胞菌胞外多糖在抑制乳腺癌细胞增殖中的应用

摘要

本发明涉及一种假交替单胞菌胞外多糖在抑制乳腺癌细胞增殖中的应用。所述的假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖的分子量为397kDa，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为4.8:50.9:44.3。本发明公开了假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖在体外能够抑制MDA-MB-231细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的生长，且这种抑制主要是通过假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡实现的。因而，该胞外多糖具有在制备抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖药物中的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种假交替单胞菌胞外多糖在抑制乳腺癌细胞增殖中的应用，属于功能糖技 术领域。

背景技术

近年来，环境污染问题日益突出，人们的免疫力逐渐低下，恶性肿瘤的发病越来越频繁， 并且其发病率也逐渐增高。恶性肿瘤已经成为了威胁人类身体健康的头号杀手，是危害生命 的严重疾病。目前，可通过外科手术、放疗及化疗等方法治疗肿瘤，但是手术无法去除已经 转移的肿瘤，放疗和化疗对于人体有严重的副作用，有些抗肿瘤药物服用之后，可能影响肝 功能，有些会影响消化系统，出现恶心、呕吐等症状，有的会引起神经毒性。因此，研究出 一种对对机体的毒副作用小，同时又能达到抑制和杀死恶性肿瘤细胞的目的药物成为抗肿瘤 药物研究的新的焦点。

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤。虽然乳腺并不是维持人体生命活动的重要器 官，原位乳腺癌不会导致生命危险，但是由于乳腺癌细胞已经失去了正常细胞的特性，细胞 和细胞之间的连接松散，细胞容易脱落。乳腺癌细胞脱落之后，游离的癌细胞会随着血液和 淋巴液扩散至全身，危及生命。近年来我国乳腺癌发病率呈增长趋势，目前乳腺癌已经成为 了威胁女性身心健康的一种常见肿瘤。目前乳腺癌的治疗方法主要为外科手术、放疗、化疗 等方法,这些方法对于人体都有一定的伤害。

多糖(polysaccharide)是由20个以上的单糖通过糖苷键链接形成的含醛基或酮基的多 羟基聚合物及其衍生物，广泛分布于动物、植物、及微生物的细胞壁中。多糖具有广泛的生 物学功能，不仅是生物体内能量的直接来源，还参与细胞间的识别，细胞间物质运输，免疫 功能的调节，肿瘤细胞的凋亡过程。大量的研究结果表明，多糖不仅具有复杂多方面的免疫 调节功能，而且多糖能够抗菌、抗病毒、抗辐射、抗肿瘤。多糖作为一种免疫调节剂，激活 机体的免疫受体，能够提高机体的免疫功能。而在癌症治疗中，多糖类药物对机体的毒副作 用小，安全性较高，同时抑瘤效果也较好。所以多糖抗肿瘤作用的研究已成为科学研究的热 点问题。研究表明，多糖抗肿瘤作用主要是对肿瘤细胞的直接作用或者是提高机体的免疫机 能。多糖对肿瘤细胞的直接作用主要表现为直接抑制肿瘤细胞的生长，改变肿瘤细胞膜的生 长特性，影响肿瘤细胞内的信号途径，对癌基因及抑癌基因的作用等。多糖提高机体的免疫 机能主要是通过影响免疫器官，活化巨噬细胞，促进细胞因子的分泌等等。

南极常年干燥、酷寒、烈风，由于南极地理环境及自然气候的特别性，给予了南极微生 物独特的生理生化特性。南极海冰中存在着大量的微生物，这些微生物可产生大量的胞外多 糖，这些胞外多糖具有良好的生物活性。前期的研究发现假交替单胞菌Pseudoaltermonas  sp.S-5胞外多糖能够在体外促进淋巴细胞的增殖。PEP能激活巨噬细胞，改变其形态，提高 免疫活性。本发明在此基础上，探究该胞外多糖对于乳腺癌细胞的作用，寻找对机体副作用 小，同时抑制和杀伤肿瘤细胞的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对机体毒副作用小，且能抑制和杀死肿瘤细胞的假交替单胞 菌胞外多糖在抑制乳腺癌细胞增殖中的应用。

本发明技术方案如下：

一种假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖在制备抑制乳腺癌细胞 MDA-MB-231增殖药物中的应用；所述的胞外多糖按如下步骤制备：

(1)将菌种保藏号为CGMCC NO.3433的假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5 经活化、扩大培养后，制得扩繁菌种；

(2)将步骤(1)制得的扩繁菌种接种于发酵培养基中，向发酵培养基中加入发酵培养 基重量0.3％的灭菌豆油后，7-9℃有氧搅拌培养50～60h，搅拌速度160～170r/min，得液 体发酵液；

(3)将步骤(2)制得的液体发酵液离心，收集上清液；

(4)将步骤(3)制得的上清液在50～60℃条件下，旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，得 浓缩液，然后向浓缩液中加入体积百分比为95％的乙醇，经醇沉后，离心，收集沉淀；

(5)将步骤(4)收集的沉淀用水溶解，加入1/3体积的seveage试剂脱去蛋白质， 制得粗糖溶液；

(6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过大孔树脂D-301R脱色后，再经过DEAE-Fast Flow 阴离子交换柱和Sephadex G-75层析柱分离，制得纯化的胞外多糖溶液；

(7)将步骤(6)制得的胞外多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得适冷微生物胞外多糖纯 品；

所述步骤(2)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分数：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％， 葡萄糖2％，氯化钠2％，人工海水余量，pH7.0。

根据本发明优选的，所述的胞外多糖成分如下：

上述假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖的分子量为397kDa，由甘露糖、 葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为4.8:50.9:44.3。

根据本发明优选的，所述的药物包括药效成分为假交替单胞菌S-5胞外多糖以及药学 上可接受的辅料。

有益效果

本发明公开了假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖在体外能够抑制 MDA-MB-231细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的生长，且这种抑制主要是通过假交替单胞菌 (Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡实现的。因而，该 胞外多糖具有在制备抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖药物中的应用前景。

附图说明

图1是Hoechst33342染色荧光显微镜照片；

其中：图1A是正常细胞荧光染色照片，图1B-D是PEP处理后的乳腺癌细胞的荧光显微 镜染色照片；

图2是Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测图；

图3是DCFH-DA探针检测细胞内活性氧变化图，其中图A是荧光强度柱状图，图B-D是 荧光显微镜照片。

图4是JC-1检测线粒体膜电位变化荧光显微镜照片；

图5是Bcl-2和Bax基因表达变化电泳图；

图6是P53基因表达变化电泳图；

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围 不限于此。

生物材料来源：

假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 菌种保藏编号CGMCC NO.3433。

实施例

该胞外多糖(PEP)的制备步骤：

(1)将菌种保藏号为CGMCC NO.3433的假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5 活化后，接种于Zobell2216E液体培养基中，9℃培养24小时，按1wt％量接种于Zobell2216E 液体培养基扩大培养，得扩繁菌种；

(2)将步骤(1)制得的扩繁菌种按10wt％的接种量，接种于液体发酵罐中的发酵培养 基，向发酵培养基中加入发酵培养基重量0.3％的灭菌豆油后，7-9℃有氧搅拌培养50h,搅 拌速度160-170r/min，得液体发酵液；

(3)将步骤(2)制得的液体发酵液在12000r/min下离心15min，收集上清液；

(4)将步骤(3)制得的上清液在60℃条件下，旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，得浓缩 液，然后向浓缩液中加入三倍体积的95％乙醇，过夜沉淀，离心，收集沉淀；

(5)将步骤(4)收集的沉淀用水溶解，加入1/3体积的seveage试剂脱去蛋白质， 制得粗糖溶液；

(6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过大孔树脂D-301R脱色后，再经过DEAE-Fast Flow 阴离子交换柱和Sephadex G-75层析柱分离，制得纯化的胞外多糖溶液；

(7)将步骤(6)制得的胞外多糖溶液经真空冷冻干燥后，制得适冷微生物胞外多糖纯 品；

所述步骤(1)中的Zobell2216E液体培养基组分如下，均为重量百分数：蛋白胨0.5％， 酵母粉0.1％，葡萄糖2％，人工海水余量，pH7.0；

所述步骤(2)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分数：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％， 葡萄糖2％，氯化钠2％，人工海水余量，pH7.0；

所述人工海水为Instant Ocean Reef Crystals海水盐配制。

经高效凝胶色谱仪(HPGPC)测定，PEP的分子量为397kDa，假交替单胞菌 (Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖PEP被水解成单糖后，经乙酰化反应，与标准单糖出峰 时间比对可以确定气相色谱峰相对应的依次为D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖，D-甘露糖、 D-葡萄糖、D-半乳糖的摩尔比为4.8:50.9:44.3。

该假交替单胞菌(Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖的制备方法也可参见中国专利文 献CN102174614A(申请号201110054901.5)中记载的制备方法。

1.1采用MTT法检测PEP对MDA-MB-231细胞增殖的影响

取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，培养24h后，分别加入含有不同浓 度的预先配制好的PEP继续培养24h，48h，然后采用MTT法测定不同浓度的假交替单胞菌 (Pseudoaltermonas sp.)S-5胞外多糖PEP对MDA-MB-231细胞的增殖影响，结果如表1所示。

表1 PEP对MDA-MB-231细胞增殖的影响

*P<0.05,**P<0.01

由表1的结果可以看出，肿瘤细胞经PEP处理后，MDA-MB-231细胞的增殖受到抑制，且 随着PEP浓度的升高，抑制率也在逐渐增加。处理24h时，抑制率由2.06％增加到42.50％；处 理48h后，抑制率由5.87％增加到44.50％，且这种抑制具有时间和剂量依赖性。

1.2Hoechst33342染色

取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于六孔板中，培养12h后，分别加入预 先配制好的PEP继续培养24h，然后采用Hoechst33342染色，结果如图1所示。

由图1可以看出，对照组细胞在荧光显微镜下细胞大小一致并且呈现弥散均匀的微弱蓝 色荧光，细胞核未见浓缩致密染色(图1A)，而经过胞外多糖作用24h后，随着PEP处理浓 度的增加，细胞核内呈浓度致密的颗粒状强蓝荧光(图1B-D)，并且出现了凋亡小体。图 1A中的箭头表示正常细胞，图1B-C箭头指示了发生凋亡的细胞。图1的结果表明PEP诱导 MDA-MB-231细胞发生了凋亡。

1.3Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量检测细胞凋亡

取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞消化计数后接种于12孔细胞培养板中，细胞帖壁 后，分别加入浓度为0、0.2、0.5、1.0mg/mL的PEP处理。培养24h后，用胰酶消化细胞，将 细胞从培养板上轻轻吹打下来，转移至2ml离心管内，3000rpm离心5min，吸弃培养液，PBS 洗涤两次后，用PBS重悬细胞并计数。取5～10万重悬的细胞，3000rpm离心5min，吸弃上清， 加入190μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，然后加入10μl Annexin V-FITC，移液枪轻吹混 匀。室温避光孵育10min。3000rpm离心5min，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液 轻轻重悬细胞。加入10μL碘化丙啶染色液，混匀后冰浴避光放置。立即上机进行检测。

在正常的细胞中，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyserine，PS)位于细胞膜内侧。但是在细 胞凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸(PS)会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，即细胞膜外侧， 磷脂酰丝氨酸暴露在细胞的外环境中。随着PEP处理浓度的增加，发生早期凋亡的细胞呈浓 度依赖性增加。

由图2可以看出，随着假交替单胞菌S-5胞外多糖PEP处理浓度的增加，发生早期凋亡的 细胞百分比也在不断增加。浓度为0.5、0.75、1mg/ml的多糖药物处理细胞时，早期凋亡的 细胞分别为11.76％、12.54％、15.82％。

1.4假交替单胞菌S-5胞外多糖PEP作用前后MDA-MB-231中活性氧的变化

取对数期生长的MDA-MB-231细胞接种于六孔板中，经不同浓度的PEP处理24h后，进行 DCFH-DA探针的装载，完成后荧光显微镜下进行观察。

如图3，细胞所呈现的荧光强度随着PEP处理浓度的增加逐渐增强，即细胞内活性氧的 浓度也在不断增加。

由图3，PEP浓度为0.25mg/ml时，荧光强度即ROS的浓度已经达到了对照组的2倍左 右，通过荧光显微镜所拍摄的图片也可以看出，对照组的细胞整体荧光与处理组相比，强度 较弱。

1.5假交替单胞菌S-5胞外多糖PEP处理MDA-MB-231细胞线粒体膜电位的变化

本实验以不同浓度的PEP(0、0.25、0.5、1mg/mL)处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞， 处理24h后，进行JC-1染色，染色后立即使用荧光显微镜进行拍照。

以不同浓度的假交替单胞菌S-5胞外多糖PEP处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞，图4 所示，对照组细胞(图4A)大部分呈现红色荧光，处理组中的细胞绿色荧光逐渐增加，红 色荧光不断减少(图4B-D)，红色荧光与绿色荧光的荧光强度比值显著下降，表明对照组 细胞的线粒体膜比较完整，膜电位较高，表明PEP处理MDA-MB-231细胞后，线粒体膜电 位下降。PEP浓度为1mg/ml时由图4D可以看出细胞的红色荧光几乎消失，此时大部分细 胞呈绿色荧光。图4结果表明随着PEP处理乳腺癌细胞后，线粒体膜遭到破坏，膜的完整 性丢失，线粒体膜电位降低。

1.6假交替单胞菌S-5胞外多糖PEP对MDA-MB-231细胞p53、Bcl-2、Bax的mRNA 表达量的影响

提取肿瘤细胞总的RNA，反转录合成cDNA,配20μL反应体系：双蒸水12μl，PCR Mix 5μl，cDNA1.0μl，引物混合物(10μM，each)2μl，总体积20μl。

引物序列如下：

P53上游AAGGAAATTTGCGTGTGGAG；下游：TTCTGACGCACACCTATTGC

Bax上游AGGATGCGTCCAAGAA；下游TTATTTGGAAGCCCTGTG

Bcl-2上游GGGGAAACACCAGAATCAA；下游GGAAGAAACTCAAGCCAC

将PCR反应所需的各种组分混匀后分装到PCR反应管内。然后轻弹离心管使液体混匀， 短暂离心，使反应组分沉于PCR管底部。将PCR反应管置于PCR仪上，设置PCR程序， 开始反应。PCR程序如下：预变性95℃，2min，变性94℃，30s，退火58℃，30s(Bcl-2)、 55℃，30s(P53和Bax)，72℃延伸30s，循环数35，72,10min。

由图5及图6可知，PEP处理后，Bcl-2的mRNA的表达量随着PEP浓度的升高不断降 低，而Bax的mRNA的表达量则随着PEP浓度的升高不断增加。抑癌基因P53基因的表达 量增加。

综上，假交替单胞菌S-5胞外多糖PEP能够抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖， 对乳腺癌的治疗有一定的辅助治疗作用。