假交替单胞菌胞外产物的特性分析及其抑菌蛋白的克隆与表达

摘要

第一部分益生菌在水产养殖中的应用
　　水产养殖业迅速发展，病害频发，利用益生菌来改善生态环境、预防治疗水产动物疾病已经越来越得到认可。本部分对水产益生菌的定义、水产养殖中常用益生菌种类以及益生菌的作用机制简单概述，并介绍了假交替单胞菌属，该属能够分泌多种生物活性物质，包括小分子化合物、蛋白质、多糖等，在水产病害防治、赤潮防治等方面具有较大的潜力。
　　第二部分假交替单胞菌m8和a22胞外产物和胞内产物抑菌活性比较
　　本部分运用玻璃纸覆盖平板法制备实验菌株的胞外产物和胞内产物，通过滤纸片法检测胞外产物和胞内产物的抑菌活性，结果表明胞外产物和胞内产物对副溶血弧菌都有抑制作用，且胞外产物的抑菌效果要好于胞内产物。为了优化制备胞外产物的培养时间，分别于培养12h、24 h、36 h和48h后制备胞外产物，然后用滤纸片法进行抑菌活性检查，并对各个时间制备的胞外产物总蛋白含量进行定量。结果表明，培养24h后制备胞外产物的抑菌活性最好且总蛋白含量在24h也达到最大值。
　　第三部分假交替单胞菌m8和a22胞外产物相关性质研究
　　将过氧化氢酶浓度设为三个梯度，分别为100μg/mL，200μg/mL，500μg/mL，测试了过氧化氢酶对胞外产物抑菌活性的影响。结果显示过氧化氢酶能够抑制胞外产物的抑菌活性，含有过氧化氢酶的滤纸片能够使抑菌圈产生缺口，但可能是滤纸片距离摆放的原因，不同浓度的过氧化氢酶产生缺口并没有明显的差异。L-氨基酸氧化酶能够催化氨基酸释放过氧化氢而产生抑菌作用，但它们的底物多种多样。用修改后的分光光度计法检测过氧化氢的产生量，将20种L-氨基酸分别作为底物，在505nm下测吸光值。结果显示， L-赖氨酸作为底物产生过氧化氢的量高于其他L-氨基酸，菌株m8的胞外蛋白添加L-赖氨酸产生过氧化氢量高于a22，这与m8的抑菌活性好于a22相对应，推测通过产生过氧化氢来产生抑菌活性。通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）及胶内活性检测，发现分子量为70KDa的蛋白条带具有抑菌活性，在胶条上形成明显的抑菌条带，并将该条带切下来进行质谱分析，结果表明，菌株 m8的70KDa蛋白条带鉴定为 TonB-dependent receptor[Pseudoalteromonas flavipulchra JG1]，菌株a22的70KDa蛋白条带鉴定为抗菌蛋白antibacterial protein[Pseudoalteromonas flavipulchra JG1]。
　　第四部分菌株a22抑菌蛋白的克隆与表达
　　根据GeneBank公布的抑菌蛋白的序列，用PrimerPremier5.0软件设计引物，以菌株基因组DNA为模板扩增目的基因，将纯化后的目的基因与表达载体pBAD/gⅢA连接，转入大肠杆菌 BL21，构建重组表达菌株 BL21/pBAD/gⅢA/2-p-1，在20℃用终浓度为0.5％L-阿拉伯糖进行诱导表达，表达产物经过S DS-PAGE显示该蛋白能在大肠杆菌中异源表达，但是表达产物的可溶部分并未检测到抑菌活性，推测可能是形成了包涵体，无法进行翻译后修饰，导致表达产物没有抑菌活性。

目录

声明

引言

第一章 益生菌在水产养殖中的应用

1益生菌概述

2益生菌的作用机制

3假交替单胞菌属

4本论文研究目的和意义

第二章 假交替单胞菌m8和a2 2抑菌组分分析

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4小结

5 讨论

第三章 假交替单胞菌m8和a2 2胞外产物相关性质研究

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4小结

5 讨论

第四章 菌株a2 2抑菌蛋白的重组表达

1实验材料与方法

2实验方法

3实验结果

4.小结

5. 讨论

参考文献

附录

致谢