禽传染性支气管炎病毒四川分离株M基因的克隆及真核表达载体构建

摘要

膜蛋白是禽传染性支气管炎病毒的主要结构蛋白，可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇，能诱导细胞介导的免疫反应，但其免疫生物学功能尚不清楚。本研究选择禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBWJ，通过RT-PCR扩增获得其膜蛋白基因M基因并插入到PGEM—T载体中，获得重组质粒PGEM—M，将重组质粒中的克隆片段进行序列测定及分析。对PGEM—M进行双酶切获得M基因片段，克隆到真核表达载体pcDNA3．1(+)中，通过菌落PCR、双酶切证明获得了M基因的真核表达质粒。利用DNAstar软件将IBVSAIBwj株的膜蛋白基因的核苷酸序列与GenBank中的国内外参考毒株进行比较，其核苷酸序列的同源率为91．6%-98．8％，氨基酸序列的同源率为91．6%-99．6％。糖基化位点的增加和减少对M蛋白的抗原性产生很大的影响。在M蛋白近N端含有两个糖基化位点，第一个跨膜疏水区距离亲水区大约20个氨基酸。SAIBwjM基因核苷酸、氨基酸进化关系可以看出，SAIBwjM与国内外参考株的同源性均较高，因此可能具有交叉保护性抗原，可望用于制备诊断试剂及制备基因工程疫苗。由于IBV变异较大，常规疫苗不能产生完全保护力。在IBV的免疫保护机制中，细胞免疫起着关键的作用，近年来一些研究者已经进行了IBVDNA疫苗的研究，并取得了一定的进展。IBV的S1基因真核表达质粒可同时诱导机体形成针对IBV的细胞免疫和体液免疫反应,由于S1基因经骨骼肌细胞内源性表达后主要通过MHCI类分子提呈抗原，特别有利于CD8+细胞毒T淋巴细胞的激活，对IBV免疫保护极有意义。陈洪岩等将鸡传染性支气管炎病毒肾型T株S1基因cDNA连接于pcDNA3构建了真核表达质粒，经肌肉注射免疫SPF鸡后血清IgG抗体逐渐升高，至35日龄左右达到高峰，但血清IgG抗体升高幅度不及IB油苗。质粒DNA免疫攻毒后有40％的鸡可耐过强毒的攻击，说明S1基因在体内获得了表达并使鸡产生了一定的免疫力。刘思国等将鸡传染性支气管炎HB株的核蛋白基因(N基)亚克隆到pcDNA3，构建了真核表达质粒pcDNA—N。用该质粒两次免疫SPF雏鸡一周后进行攻毒试验，结果保护率为40％，表明N蛋白介导的细胞免疫在抗感染中发挥了作用。现在的DNA疫苗研究主要集中在免疫原性较高的N基因和S基因，对免疫原性较低的M基因的研究，国内未见报道。国外有报道M蛋白也能刺激机体产生低水平的抗体，M蛋白上可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇，本研究将为进一步研究M基因的免疫原性及其在IBV中的作用基础材料。