猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株M基因序列分析、原核表达研究及真核表达载体构建

摘要

本研究以TGEVSC-Y株的毒种为材料扩增克隆M基因，并对其序列进行生物信息学分析；同时利用获得的M基因进行原核表达载体构建、表达及真核表达载体构建研究。主要研究结果如下： Ⅰ、参照GenBank中登录号AJ271965的TGEV基因序列，利用自行设计的一对引物，以ST细胞增殖培养的SC-Y株TGEV为材料，采用RT-PCR技术扩增出M基因，TA克隆构建获得其重组质粒pMD18-TrM。序列分析显示SC-Y株与GenBank中登录的TS、TFI、Purdue、Purdue-115、PUR46-MAD、96-133、HN2002、FS772/70、TO14株M基因核苷酸序列同源性达94％以上，氨基酸序列同源性达91％以上，表明不同毒株M基因保守性较高。M蛋白基因系统进化及其氨基酸同源性分析显示SC-Y株与美国Purdue株亲缘关系较近，同时研究发现我国TS、TFI株分别与韩国HN2002株、英国FS772/70株亲缘关系较近，而我国SC-Y、TS、TFI三株之间亲缘关系则较远，这从一定程度上说明我国TGEV可能为外国输入性。M蛋白氨基酸二级结构综合参数分析、信号肽及跨膜区预测显示，SC-Y株M前体蛋白存在有四个跨膜区(氨基酸残基位于1-16，53-75，86-104，113-135)，其中1-16位为信号肽序列；成熟M蛋白(去除信号肽)为三个跨膜区，其N端位于病毒膜外区，而C端位于病毒膜内区。SC-Y株成熟M蛋白高级结构预测显示其功能结构域在N端主要集中于氨基酸残基8-21，该区域与M蛋白的生物学功能关系密切；预测综合分析显示可形成有效抗原表位的区域在N端氨基酸残基4-30或其附近。 Ⅱ、以pMD18-TrM为材料，扩增、TA克隆构建获得M蛋白去信号肽序列基因的重组质粒pMD18-T△M。运用DNA技术，将pMD18-TrM、pMD18-T△M中M蛋白基因及其去信号肽序列基因分别转移定向克隆到pET32a(+)中，获得重组原核表达载体pET32a(+)-rM、pET-32a(+)-△M。构建成功后分别转化高效表达菌株E.coliBL21(DE3)进行表达研究。SDS-PAGE电泳检测结果显示，原核重组表达载体pET32a(+)-rM未成功表达出预期目的融合蛋白Trx-M；原核重组表达载体pET-32a(+)-△M表达出预期融合目的蛋白Trx-△M，其表达量有待进一步研究；WesternBlotting检测结果显示，表达的去信号肽目的融合蛋白Trx-△M具有特异的生物学免疫原性。 Ⅲ、根据真核表达载体pEGFP-C1多克隆位点(MCS)特点设计一对具限制性内切酶酶切位点修饰的引物，以pMD18-TrM为材料扩增、TA克隆构建获得M蛋白基因重组质粒pMD18-TRM’。运用DNA重组技术将目的基因转移定向克隆到pEGFP-C1，经PCR、双酶切鉴定，成功构建重组真核表达载体pEGFP-CRM'。

目录

文摘

英文文摘

论文独创性声明及关于论文使用授权的声明

前言

研究报告第一章猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株M蛋白基因的扩增克隆、序列及高级结构分析

研究报告第二章猪传染性胃肠炎病毒M蛋白在原核表达系统pET32a(+)中表达研究

研究报告第三章 猪传染性胃肠炎病M蛋白基因真核表达载体的构建

文献综述猪传染性胃肠炎病毒分子生物学研究进展

致谢

攻读学位期间发表论文情况

附录