猪传染性胃肠炎病毒S基因乳腺特异性真核表达载体构建的研究

摘要

猪传染性胃肠炎(Swine Transmissible gastroenteritis,TGE)是由冠状病毒科冠状病毒属中的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的高度传染性肠道疾病,主要临床症状是呕吐、严重腹泻和脱水,各种年龄及品种的猪对该病均易感,尤其对新生仔猪致死率可达100%.目前,防治该病的最有效手段是接种疫苗.常规疫苗包括弱毒疫苗和灭活疫苗,但它们在一定程度上存在着排毒、散毒、毒力返祖、免疫效果差等缺陷,故免疫效果不够理想,因此,亟需研制一种高效、安全的基因工程疫苗来从根本上防治TGE.该研究着眼于乳腺生物反应器生产药用蛋白具有安全、高效、成本低廉的优点,利用TGEV保护性抗原编码蛋白S基因、β-酪蛋白启动子和表达载体pEGFP-C1构建了TGEV真核表达质粒即基因疫苗.研究内容如下:1.该研究根据TGEV抗原编码蛋白S基因核酸序列,利用引物设计软件Primer 5.0设计了5条引物,通过RT-PCR方法直接从含有TGEV的猪肠管组织中分段克隆2 127 bp S1片段和2 450 bp S2片段,经酶切鉴定后,分别克隆至pMD-T vector,筛选阳性重组子pMD-S1和pMD-S2,穿刺培养送交测序,核酸序列分析证明与不同毒株相同序列同源性均达94%以上.S1 3'端和S2 5'端具有81 bp的重叠区,因此以S1和S2的混合物为模板,TS1和TS2为引物,重组PCR扩增出4 496 bp S基因全长序列,将其克隆至pGEM-T easy vector,酶切及PCR分析证明S基因全长序列克隆成功.2.根据表达载体pEGFP-C1上的多克隆位点及重组质粒pG-BBCP中β-酪蛋白启动子序列,设计合成引物TS1'和TA2',即在引物TS15'端添加限制性内切酶Nhe Ⅰ酶切位点,引物TA25'端添加限制性内切酶BamH Ⅰ酶切位点,利用该对引物从质粒pGEM-S上扩增S'基因,酶切鉴定PCR回收产物,然后将其克隆到pGEM-T easy vector,酶切鉴定重组质粒pGEM-S',Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切pGEM-S'并定向克隆至质粒pG-BBCP相应位点,酶切鉴定重组质粒.Sac Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切重组质粒,回收BCP-S',并在T4 DNA连接酶作用下与pEGFP-C1定向连接,酶切及PCR鉴定,分析表明TGEV乳腺特异性表达质粒(即基因疫苗)构建成功.该载体含有强启动子(人巨细胞病毒CMV),报告基因(增强型绿色荧光蛋白EGFP),抗性筛选基因(新霉素基因neo<'r>),β-酪蛋白的启动子(2.2kb5'调控成分和0.6kb3'端polyA加尾信号)及目的基因TGEV S基因.为进一步研究TGEV核酸疫苗免疫机制的可行性奠定了坚实的基础.

目录

文摘

英文文摘

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前言部分

第一章猪传染性胃肠炎病毒的研究进展

1猪传染性胃肠炎的概述

2猪传染性胃肠炎病毒研究进展

第二章DNA疫苗研究进展

1基因疫苗研究进程简介

2 DNA疫苗的制备

3基因免疫机制及优点

4 DNA疫苗的安全性和存在问题

5 DNA疫苗应用前景

第三章猪传染性胃肠炎病毒DNA疫苗研究进展

1猪传染性胃肠炎病毒转基因疫苗研究进展

2猪传染性胃肠炎可食疫苗可行性及前景

实验研究部分

第四章猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白S基因克隆

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

4小结

第五章猪传染性胃肠炎病毒S基因乳腺特异性真核表达载体的构建

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

4小结

结论

参考文献

附录

致谢

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