双歧杆菌胆盐水解酶基因的重组表达、纯化与酶学性质

摘要

为了提高胆盐水解酶在大肠杆菌中的表达量,研究重组胆盐水解酶的酶学性质.利用大肠杆菌表达系统,对双歧杆菌来源的胆盐水解酶进行了表达.将PCR获得的胆盐水解酶基因克隆至表达载体pET-22b(+),得到重组质粒pET-22b(+)-bsh,并转化大肠杆菌BL21(DE3).经发酵优化,重组菌在20℃、IPTG 1 mmol/L条件下诱导32 h可达最高酶活,对甘氨脱氧胆酸钠和牛磺酸脱氧胆酸钠的酶活分别为135.2 U/mL和121.3 U/mL.采用镍亲和层析柱对重组胆盐水解酶进行纯化,经SDS-PAGE分析,胆盐水解酶相对分子质量(Mr)为35.0×103.酶学性质研究表明,重组胆盐水解酶偏好水解甘氨结合胆盐,对甘氨胆酸钠的催化活性最高,达到220.1 U/mg.酶催化反应的动力学参数经Hill方程拟合,希尔系数大于1,表明底物与酶之间存在协同作用,且不同底物与重组胆盐水解酶之间存在不同的协同作用,表明重组胆盐水解酶属于变构酶.研究结果为其他来源胆盐水解酶在基因工程菌中的表达,和进一步研究胆盐水解酶的结构和催化反应机理提供了参考.