脂肪酶基因克隆、序列分析、表达及其催化特性

摘要

分别以R.miehei 3.4960基因组和总RNA为模板,通过PCR和RT-PCR扩增得到脂肪酶全长基因和脂肪酶cDNA碱基序列,两碱基序列测序结果比对表明:脂肪酶DNA碱基序列由5个内含子和6个外显子组成,5个内含子大小分别为75、58、64、73、59bp,位于DNA序列(以起始密码子ATG的碱基A为1)的600～674位、929～986位、1076～1139位、1227～1299位、1382～1440位碱基处.脂肪酶RML mRNA碱基序列与已公布的R.miehei脂肪酶基因mRNA(EMBL Nucleotide Sequence Database Accession No.A02536)碱基序列有5个碱基的差异,其编码的氨基酸序列有1个发生了改变.利用酿酒酵母表达质粒pICAS1,实现了脂肪酶RML基因在酿酒酵母中的高效分泌表达,并对重组脂肪酶RML进行了相关酶学性质分析.酶学性质研究表明:重组酶的最适反应温度为45℃,最适pH值为8.6;该酶偏爱中链长的酯(C8～C12),对12个碳的酯具有最佳活性,对C16长链酯也有较高的活性,对短链酯的活性较弱;金属离子Cu、Fe对酶活性有显著抑制作用,Ca和Mg对酶活有部激活作用.