脂肪酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、脂肪酶及其制备方法、及生物柴油的制备方法

摘要

本发明公开一种脂肪酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、脂肪酶及其制备方法、及生物柴油的制备方法，其中，所述脂肪酶基因TLLsyn用于编码脂肪酶，所述脂肪酶基因TLLsyn的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的脂肪酶基因TLLsyn，采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，显著提高了人工合成的脂肪酶基因TLLsyn在毕赤酵母细胞中的表达量；此外，在脂肪酶的制备过程中，将人工合成的脂肪酶基因TLLsyn转入到毕赤酵母中，并结合目的基因的多拷贝构建，提高了脂肪酶基因TLLsyn在脂肪酶中的表达量，并提高了脂肪酶的酶活，其制备工艺简单且产量高，降低了脂肪酶的生产成本。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种脂肪酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、脂肪酶及其制备方法、及生物柴油的制备方法。

背景技术

生物柴油是指以油料作物如大豆、油菜、棉、棕榈等，野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换或热化学工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料，因其具有优良的环保特性而受到广泛关注。生物柴油的制备方法包括化学法和生物酶合成法，其中生物酶合成法，是以动物油脂和低碳醇为原料，通过脂肪酶的催化作用进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯，具有条件温和、醇用量小、无污染排放的优点。

但是，目前适用于生物柴油转酯反应催化的脂肪酶，因其表达量低而使得催化效率不高，且稳定性(最常见的是耐温、耐酸碱)较差、要求反应条件苛刻，并不适用大规模生产生产柴油，而适用于生产生物柴油的脂肪酶因其技术门槛高，市场价格一直居高不下。

毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统，具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟、表达水平高以及目的蛋白分离纯化简便等优点，是异源蛋白中工业化生产的理想宿主。然而，由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用偏好性、mRNA二级结构的复杂性、基因中富含A/T或G/C区段、蛋白酶切割位点以及基因在宿主中的丰度等因素影响，异源基因在毕赤酵母中难以获得高效表达。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种脂肪酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、脂肪酶及其制备方法、及生物柴油的制备方法，旨在提高脂肪酶基因在脂肪酶中的表达量。

为实现上述目的，本发明提出一种脂肪酶基因TLLsyn，用于编码脂肪酶，所述脂肪酶基因TLLsyn的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提出一种脂肪酶，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提出一种重组表达载体，包括如上述的脂肪酶基因TLLsyn。

优选地，所述脂肪酶基因TLLsyn的拷贝数为多个。

本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上述的脂肪酶基因TLLsyn。

优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

本发明还提出一种如上述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：

将合成的脂肪酶基因TLLsyn通过酶切位点EcoR Ⅰ连接到中间载体pUC57，获得pUC-TLLsyn载体；

将pUC-TLLsyn载体和pAO815载体分别用EcoR Ⅰ酶切，电泳、胶回收脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段；

将脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-TLLsyn重组表达载体。

本发明还提出一种如上述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：

将合成的脂肪酶基因TLLsyn通过酶切位点EcoR Ⅰ连接到中间载体pUC57，获得pUC-TLLsyn载体；

将pUC-TLLsyn载体和pAO815载体分别用EcoR Ⅰ酶切，电泳、胶回收脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段；

将脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-TLLsyn重组表达载体；

将pAO815-TLLsyn重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。

本发明还提出一种如上述的脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：

将合成的脂肪酶基因TLLsyn通过酶切位点EcoR Ⅰ连接到中间载体pUC57，获得pUC-TLLsyn载体；

将pUC-TLLsyn载体和pAO815载体分别用EcoR Ⅰ酶切，电泳、胶回收脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段；

将脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-TLLsyn重组表达载体；

将pAO815-TLLsyn重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株；

培养重组表达菌株，从培养物中获得脂肪酶。

本发明还提出一种生物柴油的制备方法，包括步骤：在生物柴油转酯反应中添加如上述的脂肪酶。

本发明提供的脂肪酶基因TLLsyn，采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，显著提高了人工合成的脂肪酶基因TLLsyn在毕赤酵母细胞中的表达量；此外，在脂肪酶的制备过程中，将人工合成的脂肪酶基因TLLsyn转入到毕赤酵母中，并结合目的基因的多拷贝构建，提高了脂肪酶基因TLLsyn在脂肪酶中的表达量，并提高了脂肪酶的酶活，其制备工艺简单且产量高，降低了脂肪酶的生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中pAO815表达载体和pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体的图谱；

图2为本发明实施例1中具有脂肪酶基因TLLsynsyn单拷贝的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体的双酶切检验结果图；

图3为本发明实施例2中具有脂肪酶基因TLLsynsyn多拷贝与单拷贝的重组表达菌株发酵上清液的SDS-PAGE测试结果；

图4为本发明实施例3中不同发酵时间的发酵上清液的SDS-PAGE测试结果；

图5为本发明实施例3中不同发酵时间的酶活测试结果；

图6为本发明实施例3中脂肪酶在不同温度下放置后的酶活测试结果；

图7为本发明实施例3中脂肪酶在不同反应温度下的酶活测试结果；

图8为本发明实施例3中脂肪酶在不同pH值下的酶活测试结果；

图9为本发明实施例4中转酯率与脂肪酶添加量的关系图；

图10为本发明实施例4中转酯率与水量的关系图；

图11为本发明实施例4中转酯率与醇油比的关系图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提出一种脂肪酶基因TLLsyn，用于编码脂肪酶，所述脂肪酶基因TLLsyn的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供的脂肪酶基因TLLsyn采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性，消除了基因中富含AT或GC的区域以及脂肪酶中的蛋白酶作用位点，大大地提高了该脂肪酶基因TLLsyn在毕赤酵母细胞中的脂肪酶的表达量。此外，在脂肪酶的制备过程中，将人工合成的脂肪酶基因TLLsyn转入到毕赤酵母中，并结合目的基因的多拷贝构建，提高了脂肪酶基因TLLsyn在脂肪酶中的表达量，并提高了脂肪酶的酶活，其制备工艺简单且产量高，降低了脂肪酶的生产成本。

本发明还提出一种脂肪酶，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明中根据已有的脂肪酶基因(来源于疏棉状嗜热丝孢菌菌(Thermomyceslanuginosus))序列进行人工设计，设计出一条全新的脂肪酶基因序列，并通过人工合成的方法获得所述脂肪酶基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，命名为TLLsyn，所述脂肪酶基因TLLsyn编码出的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。根据毕赤酵母对基因的偏好性，对脂肪酶基因序列进行了人工优化，通过密码子优化后人工合成脂肪酶基因TLLsyn，有效地提高了脂肪酶基因TLLsyn中含量较高氨基酸密码子的使用频率。同时，通过优化，有效地降低了脂肪酶基因TLLsyn转录出的mRNA二级结构的复杂性，有利于脂肪酶表达量的提高，实现了高效的异源表达。

本发明还提出一种重组表达载体，包括如上述的脂肪酶基因TLLsyn。

通过人工合成的方法获得脂肪酶基因TLLsyn后，需要通过载体将目的基因导入宿主细胞，使目的基因随着宿主细胞的繁殖而复制，从而获得大量的目的基因。

重组表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体，其中，所述启动子的类型可以是强表达型启动子、组织特异性启动或诱导型启动子，在实际中，可根据实际情况选择相应的启动子来进行驱动表达。在本发明中，所述重组表达载体的启动子为甲醇诱导型启动子，且启动子位于所述脂肪酶基因的上游，用以驱动所述脂肪酶基因表达。在甲醇诱导型启动子的诱导下，所述甲醇诱导型启动子驱动上述脂肪酶基因转录表达出所述脂肪酶，具体地，在本发明的一些实施例中，所述甲醇诱导型启动子(AOX)的序列为：GACTGGTTCCAATTGACAAGC。

可选地，所述脂肪酶基因TLLsyn的拷贝数为多个。

通过增加基因的拷贝数，可增加上述脂肪酶基因TLLsyn的表达量，进一步提高脂肪酶的表达量。当然，载体上的每个脂肪酶基因TLLsyn均具有独立的启动子驱动表达。更优选地，在本发明的一些实施例中，所述脂肪酶基因的拷贝数为两个或三个。

本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上述的脂肪酶基因TLLsyn。

将上述的重组表达载体导入宿主细胞中获得重组表达菌株，目的基因即可随着宿主细胞的繁殖而复制。通常来说，所述宿主细胞可以是大肠杆菌，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞例如动物细胞等。

优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统，具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟、表达水平高以及目的蛋白分离纯化简便等优点，是异源蛋白中工业化生产的理想宿主。同时，本发明提供的脂肪酶基因TLLsyn经过密码子优化，采用了适用于毕赤酵母进行转录翻译表达出脂肪酶的高频密码子，因此，以毕赤酵母作为宿主细胞，提高了脂肪酶基因TLLsyn在毕赤酵母细胞中的表达量。

本发明还提出一种如上述的重组表达载体的制备方法，包括如下步骤：

步骤S11、将合成的脂肪酶基因TLLsyn通过酶切位点EcoR Ⅰ连接到中间载体pUC57，获得pUC-TLLsyn载体；

先在合成的脂肪酶基因TLLsyn两端加上酶切位点EcoR Ⅰ，经EcoR Ⅰ酶切后，连接至同样经EcoR Ⅰ酶切后的中间载体pUC57上，即可获得pUC-TLLsyn载体。

步骤S12、将pUC-TLLsyn载体和pAO815载体分别用EcoR Ⅰ酶切，电泳、胶回收脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段；

可选地，在步骤S11和S12中，酶切体系为：30μL的载体、2μL的EcoRI、10μL的10×Buffer、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h左右。

步骤S13、将脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-TLLsyn重组表达载体；

可选地，连接体系为：1μL的T4buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL的TLLsyn基因片段、2.5μL的pAO815片段、ddH₂O补齐至10μL；在16℃条件下连接8-10h后，转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有单拷贝脂肪酶基因TLLsyn的重组质粒pAO815-TLLsyn重组表达载体，其结构如图1所示，TLLsyn基因由AOX1甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT)终止子终止表达。

本发明还提出一种如上述的重组表达菌株的制备方法，包括如下步骤：

步骤S21、将合成的脂肪酶基因TLLsyn通过酶切位点EcoR Ⅰ连接到中间载体pUC57，获得pUC-TLLsyn载体；

先用EcoRⅠ酶切割中间载体pUC57，使中间载体pUC57露出黏性末端，然后再同样以EcoR Ⅰ酶切割脂肪酶基因TLLsyn，使脂肪酶基因TLLsyn产生相同的黏性末端，将切割后的中间载体pUC57与脂肪酶基因TLLsyn连接，即可获得重组pUC-TLLsyn载体。

步骤S22、将pUC-TLLsyn载体和pAO815载体分别用EcoR Ⅰ酶切，电泳、胶回收脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段；

可选地，可选地，在步骤S21和S22中，酶切体系为：30μL的载体、2μL的EcoR I、10μL的10×Buffer、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h左右。

步骤S23、将脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-TLLsyn重组表达载体；

可选地，连接体系为：1μL的T4buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL的TLLsyn基因片段、2.5μL的pAO815片段、ddH₂O补齐至10μL；在16℃条件下连接8-10h后，转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有单拷贝脂肪酶基因TLLsyn的重组质粒pAO815-TLLsyn重组表达载体，其结构如图1所示，TLLsyn基因由AOX1甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT)终止子终止表达。

步骤S24、将pAO815-TLLsyn重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。

可选地，通过电转仪将pAO815-TLLsyn重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。在本发明的一些实施例中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115，当然，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母菌株。

本发明还提出一种如上述的脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：

步骤S31、将合成的脂肪酶基因TLLsyn通过酶切位点EcoR Ⅰ连接到中间载体pUC57，获得pUC-TLLsyn载体；

先用EcoR Ⅰ酶切割中间载体pUC57，使中间载体pUC57露出黏性末端，然后再同样以EcoRⅠ酶切割脂肪酶基因TLLsyn，使脂肪酶基因TLLsyn产生相同的黏性末端，将切割后的中间载体pUC57与脂肪酶基因TLLsyn连接，即可获得重组pUC-TLLsyn载体。

步骤S32、将pUC-TLLsyn载体和pAO815载体分别用EcoR Ⅰ酶切，电泳、胶回收脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段；

可选地，可选地，在步骤S31和S32中，酶切体系为：30μL的载体、2μL的EcoR I、10μL的10×Buffer、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h左右。

步骤S33、将脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-TLLsyn重组表达载体；

可选地，连接体系为：1μL的T4buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL的TLLsyn基因片段、2.5μL的pAO815片段、ddH₂O补齐至10μL；在16℃条件下连接8-10h后，转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有单拷贝脂肪酶基因TLLsyn的重组质粒pAO815-TLLsyn重组表达载体，其结构如图1所示，TLLsyn基因由AOX1甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT)终止子终止表达。

步骤S34、将pAO815-TLLsyn重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株；

可选地，通过电转仪将pAO815-TLLsyn重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。在本发明的一些实施例中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115，当然，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母菌株。

步骤S35、培养重组表达菌株，从培养物中获得脂肪酶。

通过发酵培养重组表达菌株，从发酵上清液中提纯获得脂肪酶。当然，在本发明其他实施例中，也可以不经过提纯处理，直接将发酵上清液视为脂肪酶产物。具体地，通过本发明提供的脂肪酶基因TLLsyn表达出的脂肪酶在作为生物柴油转酯反应催化剂使用时，其最适pH值为8.7～9.2(优选为9.0)、最适温度为55～65℃(优选为60℃)，在此环境条件下，所述脂肪酶具有正常的生物活性，能够高效地催化生物柴油转酯反应。

本发明还提出一种生物柴油的制备方法，包括步骤：在生物柴油转酯反应中添加如上述的脂肪酶。

通过生物酶合成法制备生物柴油，是以动物油脂和低碳醇为原料，通过脂肪酶的催化作用进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙酯，具有条件温和、醇用量小、无污染排放的优点，但是目前适用于生物柴油转酯反应催化的脂肪酶，由于其基因表达量低而使得其催化效率不高。在本发明技术方案中，根据毕赤酵母的偏好性性设计脂肪酶基因序列，再将人工合成的脂肪酶基因TLLsyn导入毕赤酵母细胞中制备的脂肪酶，使得脂肪酶中脂肪酶基因TLLsyn的表达水平高，从而有效促进生物柴油转酯反应，提高转酯率。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

脂肪酶基因TLLsyn单拷贝重组表达菌株的构建，方法如下：

(1)在DNA2.0软件的辅助下设计脂肪酶基因TLLsyn序列，通过人工合成的方法获得脂肪酶基因TLLsyn片段。

(2)在合成的TLLsyn基因两端加上酶切位点EcoR I，经EcoR I酶切后，连接至经EcoR I酶切后的中间载体pUC57载体(苏州金唯智生物科技有限公司)上，得到pUC-TLLsyn载体；其中，酶切体系为：30μL的载体、2μL的EcoR I、10μL的10×Buffer、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h。

(3)将pUC-TLLsyn载体和pAO815载体(购自美国Invitrogen公司，图谱如图1所示)分别用EcoRⅠ酶切，电泳、胶回收脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段；其中，酶切体系为：30μL的载体、2μL的EcoR I、10μL的10×Buffer、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下、酶切2h。

(4)将脂肪酶基因TLLsyn片段和pAO815片段通过T4DNA连接酶连接，获得pAO815-TLLsyn重组表达载体；其中，连接体系为：1μL的T4buffer、1μL的T4DNA连接酶、5.5μL的TLLsyn基因片段、2.5μL的pAO815片段、ddH₂O补齐至10μL；在16℃条件下连接10h后，取5μL连接体系与大肠杆菌(DH5α)混匀后于冰上放置15min，然后于42℃反应1min，再置于冰上2min，最后涂布于筛选平板上筛选阳性克隆，提取质粒，即得到具有脂肪酶基因TLLsyn单拷贝重组质粒的pAO815-TLLsyn重组表达载体，其结构如图1所示，TLLsyn基因由AOX1甲醇诱导型启动子驱动，由AOX1(TT)终止子终止表达。

(5)利用电转仪将该pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体转化入巴斯德毕赤酵母GS115(美国Invitrogen公司)中，然后在YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)平板上筛选得到阳性转化子，经PCR(聚合酶链式反应)验证为正确的阳性转化子，即获得脂肪酶基因TLLsyn单拷贝重组表达菌株。其中，电转化方法为：取10μL的单拷贝pAO815-Xynsyn2重组表达载体与90μL的巴斯德毕赤酵母GS115混匀后于冰上放置5min，然后用电转化仪电击(电压1500V)，加入YPD培养基(含葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L)，于28℃孵育2h后涂布于平板上。

提取脂肪酶基因TLLsyn单拷贝重组表达载体中的质粒载体，进行双酶切验证(BglII和BamH I)，结果如图2所示(图中：M为DL5000DNA Marker，1泳道为没有酶切的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体；2泳道为单酶切后的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体；3泳道为双酶切后的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体)。由图3可知，在1000bp位置有条带，说明脂肪酶基因TLLsyn成功连接至pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体上。

实施例2

脂肪酶基因TLLsyn多拷贝重组表达菌株的构建，方法如下：

(1)将实施例1获得的pAO815-TLLsyn重组表达载体单拷贝重组表达载体用Bgl II和BamH I双酶切后，胶回收大片段，得到pAO815-TLLsyn重组表达载体片段，其中，酶切体系为：30μL的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体、1.5μL的BamH I、1.5μL的Bgl II、20μL的10×Buffer K、20μL的BSA、20μL的Triton X-100、ddH₂O补齐至200μL，37℃条件下，酶切4h。

(2)用BamH I单酶切新的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体后胶回收，将其与步骤(1)得到的pAO815-TLLsyn重组表达载体片段用T4DNA连接酶连接，得到具有脂肪酶基因TLLsyn两拷贝重组质粒的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体，将量拷贝的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母GS115宿主细胞中，筛选阳性克隆子，获得脂肪酶基因TLLsyn两拷贝重组表达菌株。

根据本实施例提供的步骤(2)，以此类推即可获得具有脂肪酶基因TLLsyn多拷贝(包括三拷贝、四拷贝等)的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体，再将多拷贝的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母GS115宿主细胞中，筛选阳性克隆子，获得脂肪酶基因TLLsyn多拷贝重组表达菌株。

(3)脂肪酶含量测试：摇瓶培养上述步骤获得的脂肪酶基因TLLsyn单拷贝和多拷贝的重组表达菌株，提取上清液，进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)，结果如图3所示(图中：1copy为含单拷贝脂肪酶基因的重组表达菌株；2copy为含两拷贝脂肪酶基因的重组表达菌株；4copy为含两拷贝脂肪酶基因的重组表达菌株)。由图3可知，四拷贝重组表达菌株(图中4copy)的上清液中的脂肪酶含量较高，这也说明两拷贝的pAO815-TLLsyn重组表达载体重组表达载体的脂肪酶的表达量较高。

(4)酸碱滴定法测试脂肪酶酶活力：

a、脂肪酶实验组制备：取1mL稀释10倍的上清液(上述步骤(3)中获得)，加入到4mL橄榄油乳化液底物(其中，橄榄油和2％聚乙烯醇水溶液的体积比为1：3)和5mL的Tris-HCI缓冲液(浓度为10mmol/L，pH值为7.5)的混合液中，于40℃水浴反应10min，用15mL的反应终止液(乙醇：丙酮＝1：1)终止反应；

b、脂肪酶对照组制备：取1mL脂肪酶置于沸水浴中5min灭活，其它同步骤(1)；

c、用0.05mol/L的氢氧化钠水溶液进行滴定，通过脂肪酶实验组与对照组消耗氢氧化钠水溶液的差值，根据酶活公式计算出脂肪酶酶活。

其中，每分钟产生1μmol脂肪酸所需的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活(U/mL)计算公式为：U＝(V2-V1)*10^3*M*N/t，其中，N为酶液稀释倍数；M为根据氢氧化钠水溶液摩尔浓度(mol/L)；t为反应时间(min)；V2为实验组滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；V1为对照组滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL)。

计算结果为：单拷贝重组表达菌株的上清液稀释10倍酶活为36U/mL；四拷贝重组表达菌株的上清液稀释10倍的酶活为67U/mL，四拷贝重组表达菌株的酶活比单拷贝提高了86.11％。在现有技术中，根据已有的脂肪酶基因(来源于疏棉状嗜热丝孢菌菌(Thermomyces lanuginosus))序列人工合成脂肪酶基因，并制备重组表达菌株，其发酵表达后的酶活约为6U/mL，相比之下，通过本发明实施例制备的脂肪酶(单拷贝)的酶活提升了6倍。

实施例3

脂肪酶的生产，方法如下：

(1)将实施例2中的脂肪酶基因TLLsyn四拷贝重组表达菌株(400mL种子液)接种至含发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，其中，发酵培养基包括：350g的KH₂PO₄、7g的CaSO₄、40g的(NH4)₂SO₄、50g的MgSO₄、120g的K₂SO₄以及560g的甘油，然后加入蒸馏水定容至7L。

(2)发酵培养各阶段的条件控制如下：

a、生物量积累阶段：罐温28℃，pH值为6.0，转速400rpm，通气量4.5L/min，持续20h；

b、营养流加阶段：步骤a之后，流加甘油和葡萄糖的混合溶液(葡萄糖10g+甘油10g)，发酵参数不变，持续2h；

c、饥饿阶段：步骤b之后，开始流加甲醇并逐渐降低转速和通气量，在2h内使甲醇含量达到0.5％，温度降到25℃(此阶段为酵母适应甲醇碳源阶段)，甲醇流速为4.0mL/L/h，流加时间为24h；

d、甲醇流加第二阶段：酵母适应甲醇后，溶氧开始下降，调节转速和通气量使溶氧维持在30％左右，温度为25℃，pH值为5.5左右，甲醇流速为4.0mL/L/h，流加时间为48h；

e、甲醇流加第三阶段：减少甲醇流速至2.5mL/L/h，使溶氧维持在20％。24h后结束发酵，得到含脂肪酶的发酵上清液。

(3)将发酵上清液提纯后，即可得到脂肪酶。

根据上述实施例3步骤(1)至(3)提供的脂肪酶生产方法，分别培养脂肪酶基因TLLsyn单拷贝和多拷贝的重组表达菌株，即可获得具有脂肪酶基因TLLsyn但拷贝和多拷贝的脂肪酶。

(4)脂肪酶产量测试：在发酵过程中，取不同的时间点(0h、24h、48h、72h、96h和120h)的发酵上清液，进行SDS-PAGE测试，结果如图4所示，并通过上述酸碱滴定法测试酶活，结果如图5所示。由4和图5可知，在发酵前期的48h之内，脂肪酶的表达量很低，这是由于此时酵母处于营养生长阶段，还没有进入甲醇诱导阶段，故脂肪酶表达量较低；营养生长阶段的酶活比较低且变化趋势也较小，进入诱导阶段后酶活开始急剧上升，在发酵后期酶活逐渐趋于稳定。在发酵时间达到120h时，脂肪酶的产量最高，此时，10L发酵液上清稀释10倍测得酶活达到67U/mL。

(5)脂肪酶的最适应用条件测试：

a、脂肪酶的最适温度测定：将本实施例制备的脂肪酶分别于40℃、50℃、60℃和70℃温度下放置10min后，通过上述酸碱滴定法测试脂肪酶酶活，结果如图6所示；将酶活测试方法中的水浴温度分别设置为50℃、60℃、70℃和80℃，分别测试酶活，结果如图7所示。由图6和图7可知，本实施例制备的脂肪酶在60℃时的反应酶活最高，说明本发明技术方案制备的脂肪酶的耐热性良好。

b、脂肪酶的最适pH值测定：将上述酸碱滴定法测试酶活方法中的缓冲液的pH值对应调整为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，分别测试本实施例制备的脂肪酶的酶活，结果如图8所示。由图8可知，脂肪酶在pH值为9.0时的反应酶活最高，这是由于嗜热丝孢菌脂肪酶本身就具有一定的耐碱性，更高的pH环境更加适合其酶活的表达。

实施例4

生物柴油的制备，方法如下：

(1)取100ml实施例3中的发酵上清液进行硫酸铵沉淀，沉淀出的蛋白加入到10mL的Tris-HCI缓冲液(pH值为7.5、浓度为50mmol/L)中，得到浓缩液。

(2)取1L浓缩液与4.58g橄榄油、840μL甲醇、560μL水进行混合，在40℃的摇床中摇晃12h，摇床的转速为200r/min，反应结束后于13000g条件下离心3min，提取上清液，即为生物柴油转酯反应的产物。

(3)取2μL的步骤(2)中的上清液与298μL的正己烷(色谱级)混合，测试转酯反应的转酯率。其中，分别测试了脂肪酶添加量、水量以及醇油比转酯率的影响，结果如图9至图11所示。由图9至图11可知，当脂肪酶的添加量为5％(相对于油脂的体积百分含量)、水量为11％(原料总体积百分含量)、醇油比为4:1(摩尔比)时，转酯率可高达73％。在其他公开文献中，用脂肪酶催化生物柴油转酯反应的转酯率最高为60％，说明以本发明实施例制备的脂肪酶作为生物柴油转酯反应的催化剂，显著提高了转酯反应的转酯率，进而提高了生物柴油的生产效率。

综上所述，本发明根据毕赤酵母的偏好性对脂肪基因进行优化设计后，将合成的脂肪酶基因TLLsyn与pAO815表达载体连接后，转入毕赤酵母GS115中表达，并结合多拷贝技术获得重组表达菌株，最后发酵培养重组表达菌株获得脂肪酶，其发酵罐培养的发酵上清液(稀释10倍)的酶活可达102U/mL，脂肪酶的最适温度为60℃，最适pH为9.0，提高了脂肪酶的酶活和表达量，且制备工艺简单、产量高；此外，当脂肪酶作为生物柴油转酯反应的催化剂使用时，当添加量为5％时，转酯反应的转酯率高达73％，降低了以脂肪酶催化生物柴油转酯反应的生产成本，还提高了转酯率，能高效的催化生物柴油转酯反应。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。