油橄榄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

摘要

采用同源克隆、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、融合引物嵌套PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)与3'-cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)技术相结合,从油橄榄(Olea europaea)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)基因全长,命名为OePAL.序列分析表明,OePAL的DNA全长2 970 bp(GenBank登录号KJ511867),含一个内含子(393～1 220 bp);全长cDNA有2 142 bp(GenBank登录号KJ511868),开放阅读框编码713个氨基酸,与其他植物有较高的同源性.利用该基因构建重组质粒pPICZα A-OePAL,且在毕赤酵母X33中进行诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)检测显示该重组酶的分子质量在77.5 kD左右,纯化后的酶比活力为196.3 U/mg.酶学性质研究表明:该重组酶的最适反应条件为40℃,pH 8.8;在供试范围内Cu2+与Na+可以提高该酶活性;以L-苯丙氨酸为底物,在最适条件下该酶的Km为4.89×10-4 mol/L.结果表明成功地克隆到OePAL,构建了表达载体,并进行了功能验证.