X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的克隆及其转录活性检测

摘要

目的:X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1能够诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3凋亡,其具体转录调控机制尚不十分清楚。克隆X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子,检测干扰素对其转录活性的影响。方法:实验于2006-05/2007-07在香港大学分子生物学研究所和洛阳华美生物工程公司完成。①材料:结肠癌细胞株Lovo和Sw1116来自美国AmericanTypeCultureCol-lection。pGL3basic载体,内参照pRL-CMV载体和Dual-luciferasereporterKit,T4DNA连接酶,限制性内切酶KpnI和XhoI均由Promega公司提供。②实验方法:采用PCR法扩增获得X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因的启动子片段,将之定向克隆到含荧光素酶报告基因的pGL3basic载体上,获得的报告基因质粒命名为pLUC107,瞬时转染Lovo和Sw1116细胞株,经α-干扰素刺激处理,启动子转录活性用荧光素酶相对表达活性表示。结果:①PCR扩增结果:在预期的271bp处出现清晰DNA片段,无非特异扩增现象,证明其为X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的PCR扩增产物。②重组质粒的酶切鉴定及测序:重组质粒pLUC107双酶切后可见约为271bp的DNA片段,与理论值相一致。DNA测序证实含X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功。③干扰素对X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子转录活性的影响:与未经α-干扰素处理的含pLUC107的Lovo和Sw1116细胞的荧光素酶相对活性值比较,经α-干扰素处理后两种细胞的荧光素酶相对活性值均明显升高(P均<0.05),且升高幅度与α-干扰素呈剂量依赖性。结论:成功克隆出X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子片段,并利用荧光素酶报告基因证实α-干扰素可上调其转录活性。