沼泽型水牛VASA基因启动子的克隆及转录活性检测

摘要

[目的]克隆沼泽型水牛VASA基因5'侧翼序列,对启动子进行生物信息学分析及转录活性检测,为后续水牛繁殖性能的分子机理研究奠定基础.[方法]根据GenBank已公布的河流型水牛(Bubalus bubalis)的VASA5'侧翼序列,经过同源比对,设计PCR引物.以沼泽型水牛血液基因组为模板扩增VASA基因5'侧翼序列并进行测序和生物信息学分析.将扩增的VASA基因5'侧翼片段插入pEGFP-1多克隆位点处,构建pVASA-EGFP-1载体.载体经脂质体转染HEK-293T和CHO细胞系,分析其转录活性.[结果]成功克隆沼泽型水牛VASA 5'侧翼序列及部分CDS区序列,共3 081 bp,同源性分析表明,沼泽型水牛VASA基因5'侧翼序列与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、小鼠和人的相似性分别为99％,96％,93％,95％,90％和79％.对其5'侧翼序列2 000 bp进行启动子预测及转录因子结合位点预测,发现在其翻译起始位点上游-635-586处存在TATA box,启动子区存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Gata3、Smad2、Smad3和Smad4等反式作用因子结合位点,其中Stat家族基因在VASA启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个Stats基因结合的情况.水牛VASA启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞中的表达,但非常微弱;能启动EGFP在CHO细胞中表达,且启动活性与CMV启动子相似.[结论]成功克隆了沼泽型水牛VASA基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性和转录活性.