一种沼泽型水牛SSR引物及其应用

摘要

本发明公开了一种沼泽型水牛SSR引物及其应用，通过构建沼泽型水牛Unigene序列，结合Perl编程语言方法，进行SSR序列查找和SSR标记引物设计，以沼泽型水牛基因组DNA为材料，对设计的SSR引物进行验证，从17201对引物中随机筛选了115对引物对7个水牛品种35头个体基因组DNA进行了验证，其中69对引物表现出多态性并可以成功区分不同地理来源的水牛材料。本发明可为水牛分子标记辅助育种提供新的分子标记，为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及沼泽型水牛SSR引物在检测不同水牛品种遗传多样性中的应 用。

【背景技术】

据FAO 2013年的统计数据显示，2011年底我国水牛存栏量为2338.2万头，仅次于印度11291.6万头 和巴基斯坦3172.6万头，位居世界第三，可谓资源丰富。中国水牛属于沼泽型类型，具有耐粗饲、役力 大、耐湿、耐高温、抗病力强等生物学特点，是我国南方地区重要的畜种，其资源丰富，奶质优良，营养 丰富，具有“奶中之王”之美称。但我国水牛产奶量较低，其泌乳性能远低于世界著名的三大河流型水牛 品种(摩拉、尼里-拉菲和地中海水牛)。为提升本地水牛的泌乳性能，我国自上世纪50年代和70年代分 别从印度和巴基斯坦引进摩拉和尼里-拉菲水牛加以改良，并取得了较大成效。尽管其产奶量得到了较大 的提高，但仍存在着明显的差异。因此，开发先进的分子标记辅助选择技术应用于优良的奶水牛品种选育， 对于改善水牛种质资源的创新与利用，尤其是有效的提高选种效率具有重要的意义。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性直接的反 映，可广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等研究 领域。微卫星标记，又称简单重复序列(SSR)，均匀分布于真核生物基因组中，由1-6个核苷酸的串联重 复片段构成。由于SSR重复基序和重复次数的不同使其在个体间呈高度变异性，且数量丰富，被广泛应用 与遗传杂交育种、绘制染色体遗传图谱等领域。与其他的分子标记(RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等) 相比，SSR标记具有多态性信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好和特异性强等特点。

目前，SSR标记可分为基因组SSR(gSSR)和转录组SSR(EST-SSR)，且后者比前者更具有经济和效率。 由于EST-SSR来源于DNA的转录区域，还比前者更具通用性。传统的SSR标记开发，一般使用文库筛选、 磁珠富集法以及EST数据库挖掘等手段，存在着费时费力、开发成本高等不足。尤其是第三种方法严重依 赖于NCBI中EST数据库，对于尚未公布基因组测序信息的物种而言，其应用是有限的。但随着第二代测 序技术的成熟，以及转录组测序数据信息的与日俱增，使其成为了开发EST-SSR的重要手段，并具有方便、 快捷、准确且成本低廉等优势。目前，沼泽型水牛尚无全基因组序列信息，且SSR引物数量又少。显然， 不依赖于参考基因组的转录组测序可成为大规模开发沼泽型水牛SSR引物的重要方法，利用该技术构建沼 泽型水牛转录本，并以转录本为参考，组建unigene序列，进行后续的SSR挖掘。鉴定出有效的沼泽型水 牛SSR标记，对于沼泽型水牛重要经济性状相关基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种等研究具有重 要的科学意义。

【发明内容】

本发明提供了一种沼泽型水牛SSR引物及其应用，本发明通过构建相应的SSR引物，对水牛个体的基 因组DNA进行SSR扩增，通过扩增产物分析沼泽型水牛的遗传多样性，为沼泽型水牛的重要经济性状相关 基因的定位、克隆及分子标记辅助选择育种等研究提供新的思路。本发明所采取技术方案是：沼泽型水牛 SSR引物在检测不同水牛品种遗传多样性中的应用，所述方法包括以下步骤：

1)沼泽型水牛SSR引物的获得：分别提取沼泽型水牛各组织器官的总RNA，利用转录组测序获得沼 泽型水牛转录组的Raw Reads，构建沼泽型水牛Unigene序列，对Unigene进行SSR位点的检索，再对含 有SSR位点信息的Unigene序列进行引物设计，获得一系列沼泽型水牛SSR引物；

2)实验材料：随机选取7个水牛品种35头个体作为模板，即摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、西林水牛、 富钟水牛、贵州水牛、德昌水牛和德宏水牛，用于检测沼泽型水牛SSR引物在不同水牛品种遗传多样性分 析中的有效性；

3)血液基因组DNA提取：针对每一头水牛个体，颈静脉取血5mL，采用动物血液基因组DNA试剂盒 (天根，北京)制备每一头水牛个体的基因组DNA。利用Nanodrop2000和1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行基 因组DNA样本质控；

4)SSR引物扩增：根据上述筛选的SSR引物，针对上述35头水牛个体基因组DNA进行PCR扩增。PCR 扩增体系(20.0μL)为：DNA模板1.0μL，引物混合物1.0μL，Premix rTaq 10.0μL，双蒸水8.0 μL.PCR反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒,58℃～60℃退火30秒,72℃延伸30秒,循 环35次；72℃延伸8分钟；

5)SSR扩增产物检测及片段大小判读：针对每一份PCR产物取10.0μL，以1：3的比例加入双蒸水 进行稀释。根据HT DNA 5K Reagent Kit(PerkinElmer,USA)的操作说明进行上机前的胶、Marker和Ladder 等试剂的灌注,之后利用LabChip GX生物大分子分析仪(PerkinElmer,USA)检测PCR产物并判读片段大 小；

6)沼泽型水牛SSR引物遗传多样性分析：采用PowerMarker 3.25软件分析35头水牛个体的等位基 因数(N_A)、期望杂合度(H_E)、观察杂合度(H_O)和多态性信息含量(PIC)等遗传参数信息，同时计算出 Nei遗传距离参数；以UPGMA算法对供试材料进行聚类分析。

本发明的优点：本发明方法具有高效、便捷、准确且成本低廉等优势，利用本发明可为水牛分子标 记辅助育种提供新的分子标记，为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究 提供新的思路。

附图说明

图1为本发明实施例2中沼泽型水牛SSR密度分布图。

图2为本发明实施例2中沼泽型水牛SSR重复单元类型和数量。

图3为本发明实施例2中沼泽型水牛SSR引物扩增情况。

图4为本发明实施例3中7个水牛品种的聚类分析图

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1沼泽型水牛Unigene序列获得及SSR引物设计

一、沼泽型水牛Unigene序列获得

1、RNA样本制备：屠宰沼泽型母水牛和公牛各1头，采集心、脑、肺、肾脏、脂肪、肝脏、脾脏、子 宫、卵巢、睾丸和乳腺11个组织，立即置于液氮里，速冻后置于-80℃超低温冰箱保存。采用Trizol试剂 分别提取各组织样本总RNA，取每个样本1.5μg，构建一个总量为16.5μg的样本混合池。

2、cDNA建库：以Dynabeads mRNA DIRECT Kit(Invitrogen，USA)从总RNA中抽提mRNA，mRNA总量大 于100ng是可以正常建库(200ng以内)，利用物理法打断mRNA样本，以随机引物反转录合成cDNA第一链， 然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过Qiaquick PCR试剂盒纯 化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加A并连接测序接头，连接产物纯化回收后做PCR扩增，PCR产物以 2％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶选择400～500bp目的条带，胶回收产物即为终文库，同时以qPCR方法对该文 库进行质控。之后用Illumina HiSeq^TM 2000测序平台对上述终文库进行测序。

3、沼泽型水牛Unigene序列组装：针对测序获得的转录组Raw Reads(见表1)，采用Trinity(版本： v2014-07-17；参数为默认参数)软件对序列进行组装，组装分为3个过程：Inchworm assembly：将测序 reads构建k-mer库，根据k-mer的overlap通过greedy K-mer extension构建contigs；Chrysalis：对 Inchworm的contigs基于k-mer-1的overlap及Reads支持进行聚类，可以聚类到一起的contigs簇作为 component构建deBruijn graphs，将测序数据比对结合到deBruijn graphs中；Butterfly：根据Chrysalis 组件信息重头构建转录本及基因的不同转录本的剪接体，得到transcripts序列。最后，我们依据component 信息得到对应物种的Unigene序列数据，并以fasta格式保存，以便于后续的注释及表达分析。

表1沼泽型水牛转录组测序数据概况

二、SSR引物的识别

1.安装Perl语言：从网站https://www.perl.org/get.html下载ActivePerl 5.20.2版本并运行；

2.安装MISA软件：从网站http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/下载MISA.Pl和MISA.ini文件， 并复制到C:\Perl64\bin文件夹下面；

3.SSR引物识别：首先将上述中Trinity软件组装的Trinity.fasta文件复制到C：\Perl64\bin文 件夹下面，然后在Perl环境下运行命令为C：\Perl64\bin\perl misa.pl Trinity.fasta(参数：默认)， 运行后产生Trinity.fasta.misa和Trinity.fasta.statistics两个文件，其中 Trinity.fasta.statistics用以获得一系列沼泽型水牛SSR引物，Trinity.fasta.misa可用于后续引物 设计；

三、SSR引物的设计

1.Primer3软件的安装：从网站http://primer3.sourceforge.net/releases.php下载Primer3 Version 2.3.6,解压后并重命名文件夹为Primer3，然后复制到C:\Perl64\bin文件夹下面；从网站 http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/primer3.html下载p3_in.pl和p3_out.pl文件并复制到 C:\Perl64\bin文件夹下面；

2.应用p3_in.pl语句产生Primer3输入文件：在Perl环境下运行命令为C:\Perl64\bin\perl  p3_in.pl Trinity.fasta.misa，运行之后产生一个名为Trinity.fasta.p3in文件，即为Primer3输入文 件，之后将Trinity.fasta.p3in复制到C:\Perl64\bin\Primer3根目录下，为产生Primer3输出文件提 供数据支持；

3.应用primer3_core语句产生Primer3输出文件：在Perl环境下运行命令为： C:\Perl64\bin\Primer3\primer3_core Trinity.fasta.p3out Trinity.fasta.p3in，产生一个名为 Trinity.fasta.p3out的文件，即为Primer3输出文件，同时将该文件复制到C:\Perl64\bin\根目录下， 便于SSR引物设计的结果产生；

4.应用p3_out.pl语句产生SSR引物设计结果：在Perl环境下运行命令：C:\Perl64\bin\perl  p3_out.pl Trinity.fasta.p3out Trinity.fasta.misa，运行之后便得到Trinity.fasta.results文件， 此即为设计好的引物。

实施例2沼泽型水牛SSR位点的挖掘

采用上述方法进行沼泽型水牛组织高通量测序，采用Trinity软件(默认参数)组装沼泽型水牛Unigene 序列，共计86021条(见表2)，为下一步鉴定沼泽型水牛SSR引物提供有效的试验数据。在Perl语言采 用MISA 1.0软件检索沼泽型水牛SSR引物，结果显示沼泽型水牛SSR引物密度分布出现频率最高的是单 碱基微卫星，其次是二碱基微卫星(见表3，图1和图2)。

表2沼泽型水牛Unigene序列概况

表3 SSR引物重复基序统计情况

在Perl语言环境下采用Primer3.0软件(默认参数)批量设计沼泽型水牛SSR引物17201对。从中 随机挑选了115对引物，对沼泽型水牛血液基因组DNA进行了PCR扩增。结果表明，共有110对引物检测 出特异性条带，证实引物设计成果率较高(见图3)。

实施例3利用SSR引物对8个水牛品种进行多态性鉴定

一、实验材料：随机选取7个水牛品种35头个体作为模板，即摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、西林水 牛、富钟水牛、贵州水牛、德昌水牛和德宏水牛，用于检测沼泽型水牛SSR引物在不同水牛品种遗传多样 性分析中的有效性，具体材料信息见表4。

表4沼泽型水牛遗传多样性分析的品种信息

二、血液基因组DNA提取：针对每一头水牛个体，颈静脉取血5mL，采用动物血液基因组DNA试剂盒 (天根，北京)制备每一头水牛个体的基因组DNA。利用Nanodrop2000和1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行基 因组DNA样本的质控。

三、SSR引物扩增：利用实施例2中筛选的SSR引物，针对上述35头水牛个体基因组DNA进行PCR 扩增。具体的扩增体系如下：

20.0μL PCR扩增体系为：DNA模板1.0μL，引物混合物1.0μL，Premix rTaq 10.0μL，双蒸 水8.0μL。

在ABI PCR仪上进行PCR反应：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒,58℃～60℃退火30秒,72 ℃延伸30秒,循环35次；72℃延伸8分钟。

四、SSR扩增产物检测及片段大小判读：

1、PCR产物稀释：针对每一份PCR产物，利用移液器分别取10.0μL置于Bio-Rad 384孔板，并 以1：3的比例加入双蒸水进行稀释。

2、Gel-Dye试剂配置：根据HT DNA 5K Reagent Kit(PerkinElmer,USA)的操作说明，在l.0mL 的Gel中加入13μL的DNA Dye，涡旋混匀之后置于过滤柱中，室温下9200RCF离心7.5分钟。

3、灌胶：在DNA 5K芯片的3、7、8和10号孔中，分别注入75μL、75μL、75μL和120μL 的Gel-Dye胶。在4号孔中加入120μL的DNA marker。

4、Ladder和Buffer准备：将12μL的DNA Ladder加入到108μL双蒸水当中，并置于0.2mL 的Ladder管；加入750μL双蒸水于Buffer管中，用于后续试验操作；

5、上机：将灌好胶的DNA 5K芯片置于芯片槽，含DNA样本的Bio-Rad 384孔板放在样品槽，而Ladder 管和Buffer管分别置于A孔和B孔，就绪后可以启动程序，等待检测结束。

6、结果分析：利用LabChip GX生物大分子分析仪(PerkinElmer,USA)自带软件分析PCR产物扩增 结果，使用者可以有效的观察到每一份PCR产物的峰图和电泳图，根据SSR预期大小，判读PCR片段大小 是否有效，便于后续试验分析。

五、沼泽型水牛SSR引物遗传多样性分析：

1、根据实施例中步骤(四)的检测结果，直接读取PCR片段的bp大小。采用PowerMarker 3.25软 件分析69对SSR引物在35头水牛个体中的等位基因数(N_A)、期望杂合度(H_E)、观察杂合度(H_O)和多态 性信息含量(PIC)等遗传参数信息(见表5)，同时计算出Nei遗传距离参数(见表6)；

表5 69对沼泽型水牛SSR引物特征概况

表67个水牛品种Nei遗传距离

2、以UPGMA算法对供试材料进行聚类分析，聚类分析结果见图4，结果表明河流型水牛群体和沼泽 型水牛群体各聚一类，其中沼泽型德宏水牛和德昌水牛聚为一亚类，其他沼泽型水牛类型则没有明显聚类。 说明水牛群体各个品种间具有丰富的多样性以及遗传上的相似性。