抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

摘要

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α)真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因.方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3.1(-)-IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析.结果:构建了pcDNA3.1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200～1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列.结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3.1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据.