利用抑制性消减杂交技术筛选太空诱变宫颈癌细胞的差异表达基因

摘要

背景：太空环境不同于地球表面的任何环境，它具有强烈的空间辐射、高真空、微磁场以及航天器中的微重力等特殊环境。大量研究表明太空特殊环境可以促使细胞性状产生变异、染色体发生畸变和基因表达发生改变等。我们前期对搭载在“神舟四号”上的宫颈癌细胞研究表明：与地面对照比较，空间诱变株的细胞克隆出现了多向性的生物学特性的改变，包括细胞形态、细胞增殖、细胞周期及恶性表型的改变。其中经有限稀释法筛选得到的空间诱变48A9 Caski细胞株与地面对照比较生长速度减慢，倍增时间延长，G1期细胞增多，S期细胞减少，在软琼脂集落实验和裸鼠成瘤实验中，恶性表型程度低。为了进一步从基因表达水平上分析空间诱变的48A9Caski细胞株细胞生物行为改变的原因，我们利用抑制消减杂交技术构建太空诱变的宫颈癌48A9Caski细胞的消减文库，从中筛选差异表达基因，探讨太空诱变宫颈癌细胞生物学行为改变的可能分子机制。 方法：采用Super SMART和SSH技术，以太空诱变的宫颈癌48A9caski细胞株作为 Tester，地面正常对照组宫颈癌细胞株作为Driver，分离太空诱变的宫颈癌48A9Caski细胞中差异表达的基因片段；连接T载体，转化宿主菌，构建太空诱变的宫颈癌 48A9Caski细胞cDNA消减文库；采用同位素<'32> P标记探针的反向Northern DotBlot技术进行筛选和鉴定；阳性克隆送交测序，BLAST 同源性比对分析，新基因片段提交GenBank。 结果：本实验成功构建了太空诱变的宫颈癌48A9Caski细胞cDNA消减文库，巢式PCR进一步使差异表达基因得到了指数扩增。产物连接载体并成功转化DH5 α大肠杆菌感受态细胞，使文库中的差异表达基因得到分离。经反向Northern Dot Blot技术筛选鉴定，确认9个基因为阳性差异表达基因。测序结果提交GenBank进行同源性比对分析，其中4条与已知基因同源，5条为未知基因片段。 结论；1.本实验利用抑制性消减杂交技术成功的构建了高质量的太空诱变宫颈癌细胞消减文库，为进一步从基因水平阐明太空特殊环境对肿瘤细胞生物学行为改变的分子机制奠定了基础。2．利用同位素标记探针和反向Northern Dot Blot技术可高通量、高灵敏的对消减文库进行筛选。 3．太空特殊环境可影响肿瘤细胞的细胞骨架、线粒体、转录调控、核酸代谢等相关基因表达的改变。4．对太空特殊环境影响肿瘤细胞生物学行为的初步探讨丰富了太空生物学研究内容，相信随着研究的进一步深入，将为肿瘤发生发展的机制研究提供一个新的视角，为肿瘤的治疗开辟一个新的道路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写注释

声明

前 言

技术路线

第一部分太空诱变宫颈癌Caski细胞消减文库的构建

1材料

2实验方法

3结果

讨论

第二部分太空诱变宫颈癌Caski细胞消减文库的筛选及生物信息学初步分析

1材料

2实验方法

3结果

讨论

结 论

参考文献

综述 太空环境对细胞基因表达的影响

致谢

硕士期间发表的论文和获得的奖励