腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRⅡ-gAD快速表达和制备

摘要

利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRⅡ-gAD(可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白)蛋白纯品.首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量(MOI) (0～1 000)感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性.用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRⅡ-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRⅡ-gAD.用rAd5-sTNFRⅡ-gAD以不同的MOI (0～1 000)感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRⅡ-gAD蛋白的表达量.在此基础上,用rAd5-sTNFRⅡ-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRⅡ-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFα的活性.结果获得了携带sTNFRⅡ-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRⅡ-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0～100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象.Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRⅡ-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高.在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRⅡ-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRⅡ-gAD融合蛋白.每个转瓶加无血清培养液100mL,每48h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3L,经过纯化获得了约11g的sTNFRⅡ-gAD融合蛋白.体外活性测定实验表明,获得的sTNFRⅡ-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用.腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学活性的sTNFRⅡ-gAD融合蛋白.该表达系统的特点是生产规模易于放大,适应无血清培养,可以反复多次收获目标蛋白.