腺病毒载体介导Smad2基因在秦川牛成肌细胞中的超表达和沉默

摘要

本实验旨在研究转化生长因子β1(TGF-β1)信号转导通路下游信号分子Smad2基因在秦川牛成肌细胞细胞的表达情况及生物学功能的发挥,从而为研究TGF-β信号通路在秦川牛肌肉和脂肪形成过程中的功能研究奠定基础.本试验首先构建了腺病毒超表达载体pAd-Smad2和重组干扰腺病毒载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-1360,并用PacⅠ限制酶酶切线性化并使用异丙醇沉淀法回收质粒大片段,转染293A细胞进行腺病毒的包装并扩繁提高病毒滴度,利用LaSRT法测定腺病毒的滴度.将获得的腺病毒pAd-Smad2和pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-572感染牛成肌细胞,利用实时荧光定量检测Smad2基因及肌肉形成的相关基因mRNA表达情况.结果表明:成功构建了秦川牛Smad2基因重组腺病毒超表达和干扰载体,将获得的具有较高滴度的超表达腺病毒pAd-Smad2,感染秦川牛成肌细胞细胞24h,48h,72h后分别较对照组Smad2基因上调了表达量显著上调了70倍,300倍,247倍左右.同样用所得到的高低度腺病毒干扰病毒pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-1360,与pAd-NC对照组相比牛成肌细胞中Smad2基因的表达量分别下调了40％,75％,80％.综上所述,在秦川牛成肌细胞中,Smad2基因能够调控成肌分化相关基因MyoD和MyoG基因的表达,对肌肉的生长发育具有调控作用.