肠炎沙门菌SipA多克隆抗体的制备及非编码小RNA RyhB-1/2对其表达调控的分析

摘要

本研究旨在通过pET原核表达系统表达沙门菌毒力蛋白SipA,制备抗SipA蛋白的多克隆抗体,以分析肠炎沙门菌SE50336非编码小RNA RyhB-1、RyhB-2对SipA的调控作用.利用pET原核表达系统构建pET28a-sipA重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化并获得最佳蛋白诱导条件后对蛋白进行诱导表达;通过10％ SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式;利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白;将纯化的SipA蛋白与弗式佐剂混合免疫BALB/c小鼠,获得SipA蛋白的特异性多克隆抗体,分析制备血清的特异性;利用Western blotting技术检测野生株SE50336、RyhB单缺失株SE50336ΔryhB-1、SE50336ΔryhB-2,以及RyhB双缺失株SE50336ΔryhB-1ΔryhB-2中SipA蛋白的表达水平,分析RyhB-1和RyhB-2对SipA蛋白的调控作用.结果 显示,试验成功构建了重组质粒pET28a-sipA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后成功表达SipA蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小为75 ku;经亲和层析纯化后,SipA蛋白纯度较高;Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体可特异性检测肠炎沙门菌SipA重组蛋白;与野生株相比,RyhB单缺失株SE50336ΔryhB-1和SE50336ΔryhB-2中SipA蛋白表达量下降,双缺失株下降则更明显,表明RyhB-1和RyhB-2均可上调SipA蛋白的表达.SipA重组蛋白的纯化及SipA多克隆抗体的制备为进一步研究RyhB-1和RyhB-2对SipA蛋白的调控作用机制奠定基础.